Untersuchungen zur Regulation der Basenfehlpaarungsreparatur und zur Zytostatikaresistenz in Säugerzellen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß eine Behandlung von Säugerzellen mit O6-Methylguanin generierenden Substanzen zu einer Zunahme der GT-Bindungsaktivität und zu einer Translokation der MMR-Proteine MSH2, MSH6 und PMS2 aus dem Cytoplasma in den Zellkern führt. Versuche mit MSH6- defizienten DLD1-Zellen und Coimmunpräzipitationsversuche zeigten, daß der MutSalpha-Komplex (MSH2+MSH6) bereits im Cytoplasma gebildet wird und daß die Translokation von MSH2 nur im Komplex mit MSH6 erfolgt. Durch die Untersuchung von Zellinien mit unterschiedlichem MGMT-Status konnte gezeigt werden, daß der DNA-Alkylierungsschaden O6-Methylguanin (O6-MeG) in Form des O6-MeGC oder O6-MeGT-Basenpaars das initiale Signal für die nukleäre Translokation von MutSalpha darstellt. Untersuchungen zur post-translationalen Modifikation der MMR-Proteine zeigten, daß MSH2 und MSH6 sowohl in vivo als auch in vitro durch die Proteinkinase C (PKC) und die Casein Kinase II (CKII) phosphoryliert werden. Es konnte gezeigt werden, daß die Phosphorylierung von MutSalpha die Effektivität der Bindung an Basenfehlpaarungen beeinflußt, da unphosphoryliertes MutSalpha in vitro nicht effektiv an GT-Fehlpaarungen binden kann. Bei der Untersuchung der Resistenzentwicklung von Melanomzellen gegenüber Zytostatika konnte gezeigt werden daß die Resistenz gegenüber Fotemustin auf einer Erhöhung der Menge des Reparaturproteins O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) beruht. Die Reaktivierung des MGMT-Gens beruht seinerseits auf einer CpG-Hypermethylierung im kodierenden Bereichs des Gens.

In this work we could show that treatment of mammalian cells with O6-Methylguanine-generating agents results in an increased GT binding activity and translocation of MMR proteins, MSH2, MSH6 and PMS2 from the cytoplasm into the nucleus. Experiments with MSH6-deficient DLD1 cells and immunoprecipitation demonstrated that the MutSalpha complex (MSH2+MSH6) is already generated in the cytoplasm, and that the translocation of MSH2 occurs solely in complex with MSH6. By means of cell lines differing in their MGMT status, it could be shown that the alkylation-generated lesion, O6-Methylguanine (O6-MeG), in the form of O6-MeGC or O6-MeGT base pair, is the initial signal for the nuclear translocation of MutSalpha. Investigations on post-translation modification of MMR proteins demonstrated that MSH2 and MSH6 are phosphorylated both in vivo and in vitro by protein kinase C (PKC) and casein kinase II (CKII). MutSalpha phosphorylation affects efficacy of binding to mismatches, since unphosphorylated MutSalpha cannot effectively bind GT mismatches in vitro. Investigations on melanoma cells resistant to the cytostatic drug fotemustine demonstrated that resistance is due to an increase in the repair enzyme O6-Methyguanine-DNA-methyltransferase (MGMT). The reactivation of the MGMT gene is caused by a CpG hypermethylation in the coding part of the gene.