Optimierte biologische Aktivität allo- und tumorreaktiver CD8-+-T-Lymphozyten im humanisierten Mausmodell durch IL-15-Superagonisten

Abstract

Interleukin 15 (IL-15) gilt als eines der vielversprechendsten zukünftigen Medikamente für die Krebstherapie. Es fördert die Proliferation, Persistenz und Funktion von CD8+ T-Zellen und vermittelt zahlreiche Effekte, die es als überlegene Alternative für das derzeit in der Klinik verwendete IL-2 erscheinen lassen. Für den Einsatz von IL-15 in der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein Protokoll zur Herstellung von rekombinantem IL-15 in E. coli etabliert. Das hergestellte Protein hatte eine zu kommerziellen Produkten vergleichbare Bioaktivität und begünstigte die Persistenz und Aktivität antigenspezifischer, humaner CD8+ T Zellen nach adoptivem Transfer in NSG-Mäuse, wobei unter anderem ein verstärkter Effekt auf T Zellen mit TSCM-Phänotyp beobachtet wurde. Um die Bioaktivität von IL-15 zu steigern, wurden super-agonistische IL-15-Fusions¬proteine entworfen und im Expi293-System hergestellt. Dabei wurde IL 15 kovalent mit der Sushi-Domäne, der IL-15Rα-Kette und einer IgG1-Fc-Domäne verbunden, was zu einer gesteigerten Affinität der IL 15-Superagonisten zum physiologischen, niederaffinen IL 15Rβγ und zu einer stark erhöhten Halbwertszeit in Mausserum führte. Die gesteigerte Affinität der IL-15-Super¬agonisten wurde durch die IL 15Rα-Sushi-Domäne vermittelt. Eine um 13 Amino¬säuren verlängerte Sushi-Domäne zeigte im Vergleich zur normalen Form eine nochmals ge¬steigerte Affinität. Die längere Halbwertszeit wurde von der Sushi- und der IgG1-Fc-Domäne vermittelt. Die IgG1-Fc-Domäne verstärkte die Wirkung der Fusionsproteine zusätzlich über einen Mechanismus, der wahrscheinlich mit der Transpräsentation durch Fc Re¬ze¬ptoren zusammen–hängt. Die gesteigerte Bioaktivität der IL-15-Superagonisten wurde im Tiermodell mit humanen und murinen T-Zellen bestätigt und ILR13+-Fc wurde als das Fusionsprotein mit der höchsten Bioaktivität identifiziert. Im Vergleich zu anderen IL-15-Superagonisten vereint es alle derzeit bekannten Eigenschaften zur Bioaktivitätssteigerung in einem einzigen Protein. In therapeutischen Versuchen mit adoptivem Transfer tumorreaktiver T-Zellen konnte der Antitumoreffekt durch ILR13+-Fc maßgeblich verstärkt werden. Als Modellsysteme wurden NSG-Mäuse, die mit humanen AML-Blasten oder einem soliden Ovarialkarzinom engraftet wurden, verwendet. Dabei wurden sowohl antigenspezifische als auch unspezifische Effekte beobachtet. Die unspezifischen Effekte wurden wahrscheinlich durch eine ILR13+-Fc-vermittelte Überexpression von NKG2D, einem Rezeptor der angeborenen Immunantwort, auf den adoptiv transferierten T Zellen vermittelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass IL-15 und die IL-15-Superagonisten die Proliferation und Reaktivität von CD8+ T-Zellen im Rahmen der Immuntherapie fördern können. Aufgrund der hohen Bioaktivität und potenzierten Wirksamkeit, könnten vor allem die IL 15-Superagonisten in Zukunft bei der Entwicklung effizienter Therapiemethoden eingesetzt werden und dadurch einen wichtigen Beitrag zu Behandlung von Krebs leisten. rnrn

Interleukin 15 (IL-15) is a promising candidate for the optimization of cancer immunotherapy. It augments the proliferation, persistence and function of CD8+ T cells and should be an effective substitute for IL-2 in most clinical and preclinical applications. In the present work, a protocol for the expression and purification of recombinant IL-15 from E. coli cultures was established and the resulting protein had a bioactivity comparable to commercial products. Furthermore, it increased the cytotoxic activity and the persistence of adoptively transferred CD8+ human T cells in NSG mice, especially for T cell populations with a TSCM-phenotype. To potentiate the beneficial effects of IL-15, three superagonistic IL-15 fusion proteins were designed and purified using the Expi293 expression system. IL-15 was covalently linked to the IL-15Rα sushi domain and the IgG1-Fc domain, resulting in an increased affinity to the physiological, low-affinity IL 15Rβγ and substantially increased serum half-life in mice. The increased affinity is dependent on the presence of the IL-15Rα sushi domain and the prolongation of this domain by 13 amino acids has been shown to further augment its affinity. The prolonged serum-half life is mediated by the IL-15Rα sushi domain and the IgG1-Fc domain. Additionally, the IgG1-Fc domain enhances the bioactivity of the IL-15 superagonists by a mechanism that probably involves trans-presentation by Fc receptors. The increased bioactivity of the IL-15 superagonists was confirmed in mouse models with murine and human T cells and the highest bioactivity was observed for ILR13+-Fc. Compared to other IL-15 superagonists, it has all the modifications that are known to raise IL-15 bioactivity combined in a single polypeptide chain. In therapeutic tumor models of acute myeloid leukemia and ovarian cancer with NSG mice including the adoptive transfer of tumor-reactive human T cells, the therapeutic effects could be markedly increased by weekly injections of ILR13+-Fc. We also observed T cell receptor-independent effects that were at least partly triggered by an ILR13+-Fc-mediated overexpression of NKG2D, an activating receptor for the innate immune system, on the cell surface of transferred T cells. The results of the present work demonstrate that IL-15 and IL-15 superagonists can augment the proliferation and reactivity of in vitro generated human CD8+ T cells for adoptive immunotherapy. Because of the substantially increased bioactivity and the potentiated efficacy, the IL-15 superagonists are valuable tools for the generation of future treatment protocols and could contribute to the development of more effective cancer therapy methods.