Aktivitätserhöhung der Alpha-Sekretasen ADAM10 und TACE bei der Proteolyse des Amyloid-Vorläuferproteins

Abstract

ZUSAMMENFASSUNGIn den Gehirnen von Alzheimer- Patienten werden beta-Amyloid-Plaques gefunden, deren Hauptbestandteile die neurotoxischen beta-Amyloid-Peptide (A-beta) sind. Im Verlauf des nicht-amyloidogenen Wegs wird das Amyloid-Vorläuferproteins (APP) innerhalb der A-beta-Sequenz durch die alpha-Sekretase prozessiert, wobei das neuroprotektive APPs-alpha freigesetzt und die Entstehung der A-beta-Peptide verhindert wird. Die Aktivitätserhöhung der alpha-Sekretase ADAM10 könnte eine übermäßige Produktion der A-beta-Peptide abwenden.Zum Auffinden ADAM10-stimulierender Substanzen konnte ein Testsystem entwickelt werden, das auf der Fusion der 119 C-terminalen Aminosäurereste des Amyloid-Vorläuferproteins mit einem Reporterprotein beruht. Durch seine alkalische Phosphataseaktivität kann dieses Reporterprotein stellvertretend für das freigesetzte endogene APPs-alpha photometrisch im Zellkulturüberstand quantifiziert werden. Substanzen, die aktivierend auf die alpha-Sekretase ADAM10 wirken, können somit schnell und mit einer hohen Empfindlichkeit ermittelt werden.Die alpha-Sekretasen ADAM10 und TACE werden als inaktive Zymogene synthetisiert und besitzen eine Proprotein-Konvertasen-Erkennungssequenz zwischen der Prodomäne und der Metalloproteinase-Domäne. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass Proprotein-Konvertasen an der Prozessierung beider Zymogene beteiligt sind. ADAM10 und TACE wurden durch die Überexpression der Proprotein-Konvertasen PC7 und Furin in HEK293-Zellen in größerem Umfang prozessiert. Dies resultierte in einer erhöhten katalytischen Aktivität. Mutiertes ADAM10 ohne Proprotein-Konvertasen-Spaltstelle konnte nicht mehr in die katalytisch aktive Form überführt werden. Diese Ergebnisse eröffnen neue Ansätze zur Stimulierung des nicht-amyloidogenen Wegs.

ABSTRACTThe amyloid-plaques found in brains of patients with Alzheimer's disease are mainly composed of beta-amyloid peptides (A-beta). In the non-amyloidogenic pathway the amyloid precursor protein (APP) is cleaved by the alpha-secretase within the A-beta-domain. Therefore, stimulation of the alpha-secretase may prevent A-beta-production.In this study a screenig test was developed which facilitates the detection of substances stimulating alpha-secretase activity. The test is based on a reporter protein consisting of the C-terminal domain of APP and an alkaline phosphatase. This protein can be detected by its alkaline phosphatase activity in the media of cultured cells. Substances, which enhance alpha-secretase activity can be determined very fast and with high sensitivity.The alpha-secretases ADAM10 and TACE are synthesized as zymogens with a proprotein convertase recognition sequence between the prodomain and the catalytic domain. In this study the role of proprotein convertases in the maturation of ADAM10 and TACE was investigated. Overexpression of the proprotein convertases PC7 and furin in HEK293 cells revealed increased ADAM10 and TACE maturation resulting in enhanced alpha- secretase-mediated processing of APP. Mutation of the proprotein convertase recognition sequence in ADAM10 confirmed the role of these convertases in ADAM10 maturation and activation. These results suggest new approaches to enhance the non-amyloidogenic alpha-secretase pathway.