Bedeutung der Survivin-Zelllokalisation für die Antwort von Zellen des kolorektalen Karzinoms auf Topoisomerase I hemmende Zytostatika

Abstract

Das kolorektale Karzinom zählt mit 1.9 Millionen Neuerkrankungen und 900.000 Todesfällen im Jahr 2018 zu den weltweit häufigsten Krebsarten (Cardoso et al., 2021, Bray et al., 2018). Aktuellen Studien zufolge ist ein Rückgang bezugnehmend auf die absoluten Fallzahlen und Inzidenzraten deutlich. Dennoch führen fast 60.000 Fälle und 25.000 der Todesfälle pro Jahr in Deutschland auf Darmkrebs zurück (Robert Koch-Institut und die Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e.V. , 2015/2016). Therapeutisch wird Irinotecan als Medikament der ersten Wahl bei einem metastasierenden kolorektalen Karzinom eingesetzt. Dieses Chemotherapeutikum basiert auf einer Beeinflussung und anschließenden Inhibition der Topoisomerase I. Bezugnehmend auf das inhibitorische-Apoptose-Protein Survivin, wurde hierbei die Beeinflussung des biochemischen Mechanismus untersucht. Survivin (BIRC5) ist das kleinste Mitglied der Familie inhibitorischer Apoptose-Proteinen (IAP-Familie) und besitzt eine duale Funktion in der Inhibition der Apoptose und der Zellteilung in der Mitose. Survivin wird in den physiologisch aktiven normalen (nicht-entarteten) Zellen exprimiert, und ist in den meisten Krebsarten überexprimiert. Infolgedessen hat Survivin einen bedeutenden Stellenwert als potenzielles onkotherapeutisches Zielmolekül. Hier sollte eine mutmaßliche Beeinflussung der zellulären Lokalisation von Survivin (Zytoplasma versus Kern) auf die DNA-Schadenantwort (DDR), DNA-Reparatur, Apoptose, und die Replikation unter Exposition mit einem Topoisomerase I-Hemmstoff sowie Irinotecan aufgeklärt werden. Weitere Untersuchungen sollen zeigen, ob eine Sensitivierung von Survivin - und XIAP- exprimierenden Kolorektalkarzinomzellen durch IAP-Inhibitoren, sowie durch Inhibitoren der DDR und DNA-Reparatur gegenüber Topoisomerase I -Inhibitoren erreicht werden kann. Die parentale Zelllinie SW48 stammt von einem Patienten mit einem fortgeschrittenem KRK (CRC Dukes TYP IV). Die rekombinante Zellklone wurden vorab durch Transfektion eines Plasmids erzeugt und in dieser Arbeit als SW48 Survivin GFP C3 (exprimiert Survivin-GFP überwiegend im Zytoplasma) und SW48 NESmut S6 (exprimiert überwiegend nukleäres Survivin-GFP Protein, bei dem nukleäre Exportsequenz ausmutiert wurde). Das klonogene Verhalten gegenüber den parentalen Zellen, zeigt deutlich, dass das zytosolische Survivin gegenüber dem nukleären Survivin eine höhere Überlebensrate aufweist, wie mittels Koloniebildungstest (Colony-forming Assay, CFA). Weiterhin wurde mittels Western-Blot und Immunfluoreszenz die Funktionalität bzw. die Richtigkeit der rekombinanten Survivin-exprimierenden Zellklone festgestellt; das Surv-GFP und das Surv-NESmut-GFP Fusionsprotein war, im Gegensatz zur parentalen Zelllinie SW48, in den rekombinanten Zellklonen stark exprimiert. Das Fortschreiten der Replikation (Replikationskapazität) wurde mittels des DNA-Fiber Assays untersucht, und es konnten Unterschiede zwischen den Zellklonen nachgewiesen werden. Die Expression des nukleären Exportsequenz (NES)-mutierten Survivins (SurvNESmut-GFP) führte zu einer signifikanten Reduktion in der Replikationsprogression. Die Voraussetzung für die Versuche war eine erfolgreiche Etablierung dieses Verfahrens (DNA-Fiber Assay), welches ein wesentlicher Teil dieser Doktorarbeit ist. Ferner wurde festgestellt, dass nukleäres Survivin im Gegensatz zum zytoplasmatischen Survivin unterschiedliche Transkriptionsprozesse unter der Behandlung mit Irinotecan aufweist. Daher scheint die subzelluläre Lokalisation von Survivin eine prognostische und therapeutische Relevanz auch hinsichtlich des Kolorektalkarzinoms zu haben. Die Forschung auf dieser biochemischen Ebene zeigt bereits vielversprechende Ansätze in der Onkotherapie. Zunehmend macht die Krebsgrundlagenforschung bemerkenswerte Fortschritte, somit wird auch eine Vielzahl von anderen Krebsarten und auch anderen Krankheiten aufgrund einer Zellzyklus-Modulation und einer Apoptose-Modulation nachvollziehbar und besser verstanden. Diese Prozesse besitzen ein enormes Potential für neue, vielversprechende Therapieansätze.