Illuminating Cas9 scission profile for precise genome editing

Abstract

CRISPR/Cas9 is a powerful genome editing platform, holding immense potential for successful gene therapy of various genetic diseases. Cas9 can generate different types of DNA double-strand breaks (DSBs) – blunt and staggered; however, what dictates Cas9 scission decision is largely unknown. Furthermore, it has been reported that the DSB end structure of the Cas9-induced cut has a direct effect on the repair outcome of loci targeted for gene editing. The scission profile remains an overlooked feature of Cas nucleases, and frequencies and determinants of the DSB end structures remain elusive. Here we developed BreakTag, a versatile, highly parallel and scission-aware methodology for the profiling of Cas9-induced DSBs to identify molecular determinants influencing Cas9 incisions. Beyond testing the fidelity of gRNAs and nucleases, BreakTag is a straightforward framework for the characterization of CRISPR-Cas nucleases. Assessing the end-structure of more than 150,000 uniquely cleaved by Cas9 loci across the human genome, we found that in addition to frequent blunt DSBs, approximately 34% of SpCas9 cut sites form staggered ends displaying 1 to 3 nucleotide 5’ overhangs. The presence of mismatches between the gRNA and the target DNA influenced the scission profile, and the ratios of blunt and staggered cuts were target-dependent. Training a machine learning model that predicts Cas9 scission profile revealed that the nuclease incision is highly dependent on the protospacer sequence, with strong sequence determinants. We further demonstrated that genetic variation impacts Cas9 cut configuration and therefore, the DNA repair outcome. Using BreakTag, we identified high-fidelity Cas9 variants with altered scission profile properties, expanding the loci amenable for highly staggered cleavage. Comparing matched datasets of Cas9 incisions and repair outcome, we established that Cas9 staggered breaks are linked with precise, templated and predictable single-nucleotide insertions, indicating that controlling Cas9 staggered cut profile could allow prediction of repair genotypes with desirable indels. We demonstrated in a proof-of-principle experiment that a scission-aware gRNA design can be leveraged for correcting pathogenic single-nucleotide deletions, demonstrating the clinical application of staggered cleavage. Our work illuminates fundamental characteristics of the Cas9 nuclease and lays the foundation for harnessing the flexible Cas9 cut profile and engineered variants for precise template-free genome editing.

CRISPR/Cas9 ist eine leistungsstarke Plattform zur Genom-Editierung und birgt enormes Potenzial für die erfolgreiche Gentherapie verschiedener genetischer Erkrankungen. Cas9 kann unterschiedliche Arten von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) erzeugen – stumpfe und versetzte; jedoch ist weitgehend unbekannt, was die Entscheidung von Cas9 für einen bestimmten Schnitt beeinflusst. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die Struktur der DSB-Enden des von Cas9 induzierten Schnitts einen direkten Einfluss auf das Reparaturergebnis der für die Genbearbeitung anvisierten Loci hat. Das Schnittprofil bleibt ein übersehenes Merkmal von Cas-Nukleasen, und die Häufigkeiten und Determinanten der DSB-Endstrukturen sind nach wie vor unklar. Hier haben wir BreakTag entwickelt, eine vielseitige, hochparallele und schnittbewusste Methodik zur Profilierung von Cas9-induzierten DSBs, um molekulare Determinanten zu identifizieren, die Cas9-Schnitte beeinflussen. Über die Prüfung der Genauigkeit von gRNAs und Nukleasen hinaus ist BreakTag eine unkomplizierte Methode zur Charakterisierung von CRISPR-Cas-Nukleasen. Untersuchung der Endstruktur von mehr als 150.000 einzigartig von Cas9 geschnittenen Loci im gesamten menschlichen Genom zeigte, dass zusätzlich zu den häufigen stumpfen DSBs etwa 34 % der SpCas9-Schnittstellen versetzte Enden mit 1 bis 3 Nukleotid-5'-Überhängen bilden. Fehlpaarungen zwischen der gRNA und Ziel-DNA beeinflussten das Schnittprofil, und die Verhältnisse von stumpfen und versetzten Schnitten waren zielabhängig. Trainieren eines maschinellen Lernmodells, das das Cas9-Schnittprofil vorhersagt, ergab, dass der Nuklease-Schnitt stark von der Protospacer-Sequenz abhängt, mit starken Sequenzdeterminanten. Wir zeigten weiterhin, dass genetische Variation die Cas9-Schnittkonfiguration beeinflusst und somit das DNA-Reparaturergebnis. Mit BreakTag identifizierten wir hochfidele Cas9-Varianten mit veränderten Schnittprofileigenschaften, die die Anzahl der für stark versetzte Schnitte geeigneten Loci erweitern. Durch den Vergleich übereinstimmender Datensätze von Cas9-Schnitten und Reparaturergebnissen stellten wir fest, dass Cas9-induzierte Brüche mit präzisen, vorlagenbasierten und vorhersagbaren Einzel-Nukleotid-Insertionen verbunden sind, was darauf hinweist, dass die Kontrolle des Cas9-versetzten Schnittprofils die Vorhersage von Reparatur-Genotypen mit wünschenswerten Insertionen und Deletionen ermöglichen könnte. In einem Proof-of-Principle-Experiment demonstrierten wir, dass ein schnittbewusstes gRNA-Design genutzt werden kann, um pathogene Einzel-Nukleotid-Deletionen zu korrigieren, Diese Ergebnisse unterstreichen die klinische Relevanz des Cas9-induzierten versetzten Schnittprofils. vii Unsere Arbeit beleuchtet grundlegende Eigenschaften der Cas9-Nuklease und legt den Grundstein für die Nutzung des flexiblen Cas9-Schnittprofils und neu entwickelter Varianten für präzise, vorlagenunabhängige Genom-Editierung.