First contact imaging of nanoparticular siRNA – From synthesis to application of a prodye concept

Abstract

Delivery of therapeutic nucleic acid based drugs is still very demanding and difficult to manage and monitor. For this reason, a precise method for the monitoring of RNAi pathways is necessary. This thesis explores a new approach for sensing of potentially therapeutic nucleic acids, using the interaction of so called prodyes with intracellular enzymes in a prodrug manner. To realize this concept, some non-fluorescent, fluorescein based asymmetric dyes were synthesized and their spectroscopic characteristics were studied. Azide-alkyne Click chemistry was applied for conjugation purposes, using a new protocol at weak acidic pH to get intact prodye constructs. Both, an electrophoretic mobility shift assay with polyacrylamide gels and in-cuvette experiments showed remarkable OFF-to-ON behavior of these new siRNA constructs under physiological conditions. After salt-free purification, subsequent hybridization to double-stranded ribonucleic acids and nanoformulation to lipoplexes, the prodye conjugated siRNA was examined in cellular uptake studies for First Contact Imaging. The investigated siRNA-prodye conjugates showed strong sensitivity to esterases, being hydrolyzed at the biolabile function and developing a strong fluorescence which was verified in bulk. As an optimization, a new profluorescent molecule system was designed and synthesized, which has a carbonate as biolabile 6’ protecting group and a highly water soluble 3’ clickable linker. This new non-fluorescent but colored prodye showed 12 - 320 times increased fluorescence intensities between OFF- and ON- states, depending to the deprotection method. This is the first reported molecule model of an asymmetric profluorescent fluorescein, having the very favorable 3’ & 6’ functions.

Der gezielte Wirkstofftransport und die Freisetzung von therapeutischen Nukleinsäuren ist weiterhin eine große Herausforderung in den therapeutischen Lebenswissenschaften. Um dieses Problem zu lösen, ist eine präzise Untersuchungsmethode der RNA-Interferenz-Wege nötig. Diese Doktorarbeit beschreibt die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Untersuchung potentiell therapeutischer Nukleinsäuren am Beispiel profluoreszenter Farbstoff-Nukleinsäure Konstrukte. Um das Konzept zu verwirklichen wurden einige neuartige profluoreszente, farblose und asymmetrische Fluoreszeine organisch-präparativ synthetisiert und ihre spektroskopischen Eigenschaften untersucht. Click-Konjugationschemie auf Basis von organischen Aziden und Alkinen wurde im schwach Sauren angewandt, um intakte Prodye-Nukleinsäure-Konstrukte zu bilden. Gel-permeationschromatographische Untersuchungen und Küvettenexperimente zeigten bemerkenswerte hyperchromische Effekte dieser neuen Konstrukte unter physiologischen Bedingungen. Nach salzfreier Aufreinigung, anschließender Hybridisierung zu doppelsträngigen Ribonukleinsäuren und Formulierung zu Lipoplexen wurden die Prodye-siRNA Konstrukte in vitro auf den Erst-Kontakt mittels CLSM untersucht. In Küvettenexperimenten konnte nach erfolgter Hydrolyse der esteraseempfindlichen Schutzgruppen starke Fluoreszenz gezeigt werden, jedoch nicht eindeutig in zellulären Aufnahmeexperimenten. Als mögliche Optimierung des Ansatzes wurden neue profluoreszente Fluoreszeine modelliert und synthetisiert, welche an 6‘-Position eine biolabile Carbonatfunktion und an 3‘-Position eine wasserlösliche „clickbare Azid Funktion“ an der aliphatischen Linker besitzen. Diese neuen, nicht-fluoreszierenden, aber farbigen Moleküle haben 12 – 320-fache hyperchromische AUS-zu-AN-Quoten. Dieser neue Ansatz mit 3‘ und 6‘ Funktionen des Fluoreszeins ist noch nicht in der Literatur berichtet.