Nanocapsule-based vaccination for inhibition of tumor escape mechanisms

Abstract

Tumor-associated tolerance mechanisms promote tumor growth and greatly inhibit the success of anti-cancer therapies. Regulatory T cells (Tregs) critically contribute to tumor-associated tolerance and are involved in IL-10- and signal transducer and activator of transcription (STAT) 3-mediated cancer-induced immunosuppression. In this study, CD25+ T cells with focus on Tregs were cell-specifically addressed by using human IL-2 functionalized hydroxyethyl starch (HES-D-IL-2) nanocapsules (NC). After coupling to the NC surface, the targeting vector human IL-2 was still fully biological functional and only a negligible amount of non-attached IL-2 was present in the NC supernatant. Flow cytometry and laser scanning microscopy experiments revealed an enhanced uptake/binding and intracellular localization of HES-D-IL-2 by human CD4+CD25+ activated T cells compared to control NC. Additionally, HES NC with a twofold (HES-D-IL-2/2) and tenfold (HES-D-IL-2/10) reduced amount of surface IL-2 were generated. In all tested NC-coupled IL-2 concentrations, flow cytometric experiments highlighted a reduced uptake/binding of HES-D-IL-2 by human naïve CD4+CD25- T cells in comparison to human activated T cells. Furthermore, the uptake by naïve and activated T cells was dose- dependent on the amount of IL-2 that was present on the NC surface. In contrast, human CD4+CD25high Tregs demonstrated the highest uptake. Intriguingly, the uptake of HES-D-IL-2 by Tregs was IL-2 dose-independent, revealing a high IL-2 receptor affinity and preferably targeting of Tregs by low amounts of IL-2. Furthermore, CD25 staining and blockade by the monoclonal chimeric antibody basiliximab (anti-CD25-mAb) indicated a CD25-dependent uptake/binding of HES-D-IL-2. This was confirmed by competitive studies using naïve CD4+CD25- and activated CD4+CD25+ human T cells. Furthermore in vivo experiments using wild-type C57BL/6 mice, and immunodeficient RAG2-/-γ-/- mice reconstituted with human CD4+ T cell or human peripheral blood mononuclear cells, revealed a successful CD25-specific targeting of murine and human CD4+ and CD8+ T cells in vivo. In order to inhibit STAT3-mediated immune tolerance in Tregs, ovalbumin protein NC with known high intracellular release capacities were generated and applied to HeLa cells to perform proof-of-principle experiments. After encapsulation of the specific STAT3 inhibitor S3I-201, an inhibition of STAT3 phosphorylation was observed in vitro. Targeting of Tregs and cytotoxic T cells by HES-D-IL-2 in combination with inhibition of STAT3-mediated tolerance by the ovalbumin protein NC may inhibit tumor-associated immunosuppression thus leading to enhanced tumor rejection.

Tumor-assozierte Toleranzmechanismen fördern das Tumorwachstum und führen zu einer abgeschwächten therapeutischen Effektivität. Regulatorische T-Zellen (Tregs) tragen entscheidend zur Tumor-induzierten Toleranz bei und sind an der IL-10- und STAT3-mediierter Tumor-assoziierter Toleranzinduktion beteiligt. In der vorliegenden Studie wurden humane T-Zellen mit Fokus auf Tregs spezifisch mit IL-2 funktionalisierten Nanokapseln (HES-D-IL-2) addressiert. Funktionale Analysen zeigten, dass das IL-2 nach Anbindung an die Kapseloberfläche noch komplett biologisch funktional war und sich nur noch ein geringer Anteil an freiem IL-2 im Überstand der Kapseln befand. Mit Hilfe durchflusszytometrischer und konfokaler lasermikroskopischer Analysen wurde eine Aufnahme/Bindung und intrazelluläre Lokalisation von HES-D-IL-2 im Vergleich zu Kontrollkapseln in humanen aktivierten CD4+CD25+ T-Zellen festgestellt. Anschließend wurden Nanokapseln mit der zweifach (HES-D-IL-2/2) und zehnfach (HES-D-IL-2/10) reduizerter Menge an IL-2 auf der Oberfläche synthetisiert. In allen getesteten IL-2-Konzentrationen wiesen Vergleichsstudien eine geringere Aufnahme/Bindung von HES-D-IL-2 in naiven CD4+CD25- T-Zellen im Vergleich aktivierten T-Zellen auf. Außerdem zeigte sich die Aufnahme in naive und aktivierte T-Zellen abhängig von der Menge an IL-2 auf der Kapseloberfläche. Im Gegensatz dazu war die Aufnahme/Bindung an regulatorische CD4+CD25high T-Zellen am höchsten und interessanterweise unabhängig von der IL-2-Konzentration auf den Kapseln gleichbleibend hoch. Diese Ergebnisse deuten auf eine erhöhte IL-2-Rezeptoraffinität und ein bevorzugtes Targeting regulatorischer T-Zellen bei niedrigen IL-2-Konzentrationen hin. Zusätzlich demonstrierten die Färbung und das Blockieren von CD25, durch den monoklonalen Antikörper Basiliximab (anti-CD25 mAB), eine CD25-abhängige Aufnahme/Bindung der IL-2 funktionalisierten Nanokapseln. Diese CD25 Abhängigkeit konnte in Kompetitionsstudien mit naiven und aktivierten T-Zellen bestätigt werden. Außerdem konnte in Experimenten mit Wildtyp C57BL/6 und immundefiziente RAG2-/-γ-/- Mäusen, die mit humanen CD4+ T-Zellen oder mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut rekonstituiert wurden, nachgewiesen werden, dass murine und humane CD4+ und CD8+ T-Zellen CD25-abhängig mit HES-D-IL-2 spezifisch in vivo adressiert werden können. Um Treg-spezifisch, STAT3-mediierte,Tumor-assoziierte Immuntoleranz zu inhibieren, wurden Proteinkapseln aus Ovalbumin hergestellt die eine hohe intrazelluläre Freisetzungsrate aufweisen und an HeLa Zellen getestet, um Proof-of Principle Experimente durchzuführen. Nach Verkapselung des spezifischen Inhibitors S3I-201 wurde eine Inhibition der STAT3 Phosphorylierung in vitro beobachtet. Das Zell-spezifische Addressieren von Tregs und Effektor T-Zellen in Kombination mit der Inhibition STAT3-vermittelten tumor-assoziierten Toleranzmechanismen könnte die Tumor-induzierte Immunsuppression verringern und zu einer verstärkten Tumorantwort führen.