Analyse von Biotransformationen und Naturstoffsynthesen in pflanzlichen Zellkulturen unter Anwendung der in vivo NMR-Spektroskopie ohne Markierung

Abstract

Die Aufklärung von Biosynthesewegen erfolgt häufig mit Hilfe von Fütterungsexperimenten mit radioaktiven oder stabilen Isotopen markierten Präkusoren oder auf der Basis der Enzymreinigung mit anschließender molekularbiologischer Charakterisierung. Die erstgenannte Methode verlangt die Isolierung der Produkte. Jedoch besteht bei Aufarbeitung und Extraktion immer die Gefahr, daß sich der Metabolit teilweise oder vollständig chemisch verändert. Ein weiterer Nachteil der genannten Methoden ist, daß diese generell mühsam und zeitaufwendig sind. Mit Hilfe der in vivo NMR-Spektroskopie können diese Nachteile umgangen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Biotransformationen und Biosynthesesequenzen des Ajmalin-Biosyntheseweges mit Hilfe der in vivo NMR-Spektroskopie in Pflanzenzellkulturen von Rauvolfia serpentina und Rauvolfia serpentina x Rhazya stricta anhand der natürlichen 13C-Häufigkeit untersucht. Dafür wurden ein 700 MHz, 800 MHz und ein 500 MHz CryoProbe Spektrometer eingesetzt, um die Biotransformationen von Isatin-3-oxim und Isatin sowie die Metabolisierungen der Alkaloide Vellosimin, Vinorin, Vomilenin, Ajmalin, Nß-Methyl-dihydrochano-ajmalin und Perakin mit der 1H-13C invers korrelierten NMR-Spektroskopie zu verfolgen.

Delineation of biosynthetic pathways is usually achieved by feeding experiments with radioactive isotopes, stable isotope incorporation or enzymatic investigations. These methods require the isolation and identification of metabolic intermediates and end products after destruction of the living cell. Since this procedures might cause artefact formation and are in general tedious and extremely time consuming, non-invasive techniques could avoid these disadvantages. In recent studies using metabolic highly active cell suspension cultures of Rauvolfia serpentina and Rauvolfia serpentina x Rhazya stricta, biotransformations and biosynthesis of secondary metabolites could be followed by in vivo NMR at the natural abundance of 13C. Frequencies of 700 MHz, 800 MHz and 500 MHz (CryoProbe) and the inverse correlated 1H-13C NMR spectroscopy were applied to monitor the biotransformations of isatin-3-oxime and isatin and the metabolisations of the alkaloids vellosimine, vinorine, vomilenine, ajmaline, Nß-methyl-dihydrochano-ajmaline and perakine.