Investigations of the UV-induced DNA damage response in human cells and zebrafish embryos

Abstract

Organismen sind durch die Sonne ständig ultraviolettem (UV) Licht ausgesetzt, was zu verschiedenen DNA-Schäden führt. Daher haben die Zellen DNA-Reparaturwege wie die Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER) entwickelt, um durch UV-Licht verursachte DNA-Schäden effizient zu reparieren. Defekte im NER-Signalweg werden mit der Entstehung von Krankheiten wie dem Cockayne-Syndrom und Melanomen in Verbindung gebracht. Viele Studien untersuchten die Signalwege, die durch UV-Licht-Bestrahlung in menschlichen Krebszelllinien ausgelöst werden, doch nur wenige Studien untersuchten diese Signalwege in ganzen Organismen. Zebrafische sind in freier Wildbahn UV-B-Licht ausgesetzt, da UV-B-Licht durch klares Wasser dringt [1]. Zebrafische entwickeln Krebsarten, die menschlichen Tumoren sowohl auf molekularer als auch auf histopathologischer Ebene ähneln, und verfügen über konservierte DNA-Reparaturmechanismen, einschließlich des NER-Signalwegs [2]. Daher sind Zebrafische ein gut geeigneter Modellorganismus zur Untersuchung der DNA-Schadensreaktion auf UV-Licht. In unserer Studie verwendeten wir UV-C-Bestrahlung, da sie DNA-Addukte, insbesondere Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere (CPDs) und 6-4-Photoprodukte (6-4PPs), erzeugt welche die Elongation der RNA-Polymerase II hemmen. Wir untersuchten die genregulatorischen Mechanismen, die es Zebrafisch-Embryonen ermöglichen, sich gegen UV-C-induzierte DNA-Schäden zu wehren. Wir haben modernste quantitative Proteomik- und Genomikansätze angewandt, um die Reaktion von Zebrafischembryonen auf UV-C-Strahlung zu untersuchen. Wir verglichen die Veränderungen der Proteinkonzentrationen, der von Phosphorylierung und Ubiquitylierung abhängigen Signalübertragung und der Genexpression bei der frühen und späten Reaktion auf UV-C-Bestrahlung. Mithilfe der quantitativen Phosphoproteomik konnten wir eine erhöhte Phosphorylierung von Proteinen feststellen, die an der Translation und DNA-Reparatur beteiligt sind. Darüber hinaus erfolgte die UV-C-induzierte Phosphorylierung an einem spezifischen Sequenzmotiv (S/TQ), das von den Proteinkinasen ATM und ATR gesteuert wird. Wir entdeckten Stellen, die beim Menschen vorkommen und auch in Zebrafisch-Embryonen konserviert sind, wie VCP (S784) und nucks1a (S52). Wir fanden eine erhöhte Phosphorylierung von Serin 115 in NELFE, von dem wir zuvor gezeigt haben, dass es für die Transkriptionsregulation nach UV-C-Licht-induzierten DNA-Schäden wichtig ist [3]. Zu den auffälligen Unterschieden zwischen den Proteinkinasen, die nach UV-C-Belastung in menschlichen Zellen und Zebrafischembryonen aktiviert werden, gehören G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen (GRKs) und transformierende Wachstumsfaktor-Rezeptoren (TGFBR). Darüber hinaus führt die Exposition gegenüber UV-C-Strahlung zu einer Verringerung des Gesamtniveaus von Proteinen, die an der DNA-Replikation und ATP-Produktion beteiligt sind. Wir fanden eine Anreicherung von Proteinen, die mit Paraspeckles, mRNA-Verarbeitung und Spleißfaktoren in Verbindung gebracht werden. Die von uns gefundenen, differenziell exprimierten Gene sind mit Zellzyklus-Stillstand und DNA-Schadensreaktion assoziiert. Um schließlich die durch UV-C-Bestrahlung induzierten Veränderungen im Ubiquitin-Signalweg zu untersuchen, kombinierten wir einen Pulldown mit einer hochaffinen Ubiquitin-Bindungsdomäne (UBD) mit quantitativer Proteomik in Zebrafischembryonen [4]. Wir fanden eine erhöhte Ubiquitylierung von Proteinen, die an der RNA-Verarbeitung und DNA-Reparatur beteiligt sind, insbesondere von Faktoren, die am Reparaturweg der Fanconi-Anämie (FA), FANCI und FANCD2, beteiligt sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie den ersten Überblick über die UV-C-induzierte DNA-Schadensreaktion in Zebrafisch-Embryonen liefert.