Die Entwicklung und Charakterisierung von Kollagenlaminaten mit proangiogenen, proosteogenen sowie antimikrobiellen Eigenschaften

Abstract

Knochenbrüche kritischer Größe stellen in der Orthopädie und Unfallchirurgie ein großes Problem dar. Dabei kommt es häufig zu einer gestörten Frakturheilung, bei der sich der Knochen selbst nicht wieder vollständig regeneriert. Bleibt eine Heilung für länger als 6 Monate aus, spricht man von einer Pseudarthrose. Gründe dafür können neben bestimmten Lebensumständen wie Rauchen vor allem Infektionen sein. Außerdem gehen solche Komplikationen oft mit einer fehlenden Osteogenese und einer mangelnden Angiogenese einher. Als Goldstandard zur Behandlung solcher Brüche zählt das autologe Knochentransplantat. Bei diesem Ansatz gibt es allerdings nicht zu vernachlässigende Nachteile wie beispielsweise eine zweite Operation, Donormorbidität und begrenztes Knochenmaterial. Abhilfe hierfür können Biomaterialien mit definierten mechanischen Eigenschaften schaffen, welche durch das Einbringen verschieden wirksamer Komponenten zur Infektionsprävention beitragen und gleichzeitig die Knochenregeneration fördern. Dafür wurden in dieser Arbeit Kollagenlaminate entwickelt, die mithilfe des Antibiotikums Vancomycin die Ausbildung einer Infektion verhindern und über den osteogen wirkenden Faktor BMP-7, sowie über den angiogen wirkenden Faktor SDF-1α zu einer verbesserten Frakturheilung führen sollen. Vancomycin ist ein in der Orthopädie häufig eingesetztes Antibiotikum. Dennoch ist wenig über dessen Toxizität bei lokaler Gabe bekannt. Die Toxizität wurde in dieser Arbeit zunächst an verschiedenen Zellen, welche an der Knochen- und Gewebsregeneration beteiligt sind, untersucht. Dabei zeigte sich bereits bei Konzentrationen von 0,01 mg/mL ein negativer Effekt auf die Viabilität von primären humane Myoblasten und den osteoblasten-ähnliche Zellen SaOS-2. Weiterhin konnte eine gesteigerte Sensitivität gegenüber Vancomycin bei den Funktionalitätstests der humanen primären Osteoblasten und der Myoblasten festgestellt werde. Die Herstellung der Laminate erfolgte mittels photochemischer Quervernetzung mit Bengalrosa (RB) und grünem Licht (RGX). Die drei käuflich erworbenen Kollagenmembranen Collagen Solutions (C), Atelokollagen (A) und Viscofan (V) sollten hierbei zur Herstellung genutzt werden. Zunächst wurde der Einfluss der RB-Konzentration (0,1 % und 0,01 %) und der Belichtungsdauer (10 min und 60 min) auf das Proliferationsverhalten von humanen primären Osteoblasten und Fibroblasten bzw. Myoblasten auf C als Modellkollagen untersucht. Dabei zeigt die Dauer der Belichtung keinen Einfluss auf die Zellviabilität, wohingegen bei einer RB Konzentration von 0,1 % ein negativer Einfluss auf die primären Osteoblasten gemessen werden konnte. Die verschiedenen Kollagene wurden weiter anhand eines Proliferationsassays bezüglich ihrer Biokompatibilität untersucht. Dabei zeigte sich auf C eine Viabilität der humanen Osteoblasten nahe der Kontrolle, welche durch RGX-Behandlung weiter steigt und von A zu V abnimmt. Auf Grundlage dessen wurde V für die weitere Entwicklung exkludiert. Da sowohl das Antibiotikum als auch die Biomoleküle direkt am Vernetzungsprozess teilnehmen, wurden deren Aktivitäten nach RGX-Behandlung untersucht. Diese Aktivitätstestung erfolgte bei Vancomycin über die Bildung eines Hemmhofs, bei SDF-1α anhand eines Proliferationsassays und bei BMP-7 durch seine osteogene Aktivität. Dabei zeigt sich, dass die Aktivität erhalten bleibt und die Behandlung mit RGX, einen vom Kollagen abhängigen Einfluss ausübt. Abschließend wurden C und A (+/- RGX) und die daraus hergestellten Laminate über Zugversuche und Dickenmessungen nach Zellkontakt (24 h und 72 h) mechanisch charakterisiert. Proliferationsversuche und in vitro-Zytotoxizitätsassays sollten zu einem besseren Verständnis der zellabhängigen Destabilisierung führen. In den Zugversuchen zeigte sich für C wie auch für A eine Abnahme in verschiedenen mechanischen Parametern nach RGX-Behandlung. Diese Werte konnten über Laminatherstellung mit einer zweiten Kollagenschicht verbessert werden. Bei einer weiteren dritten Schicht war keine lineare Zunahme erkennbar. Die Dickenmessungen zeigten eine zellabhängige wie auch eine kompositionsabhängige Destabilisierung der Laminate. Weiter konnte ein Zusammenhang zwischen Proliferationsverhalten und in vitro-Zytotoxizität hergestellt werden. Die in der Arbeit dargelegten Ergebnisse zeigen deutlich, dass das photochemische Quervernetzen mit RGX eine vielversprechende Methode zur Herstellung der Kollagenlaminate ist. Durch das Einbringen verschieden aktiver Moleküle besteht die Möglichkeit, eine beschleunigte Frakturheilung zu initiieren. Dabei können Materialien mit maßgeschneiderten mechanischen Eigenschaften hergestellt werden. Über die Anzahl der Schichten besteht die Möglichkeit die Freisetzungskinetik durch die Laminatstabilität und der davon abhängigen Degradierung einzustellen. Generell zeigt dieser Ansatz eine vielversprechende zukünftige Methode zur Behandlung von Knochenbrüchen kritischer Größe.