Single Line Imaging Method (SLIM) for Biochemical Applications

Abstract

Single-particle dark-field microscopy enables the study of molecular interactions, determining binding constants and measuring dynamic processes. However, the number of nanoparticles that can be detected simultaneously combined with high time resolution is still a requirement that limits the method's applicability in the presence of spatiotemporal heterogeneity of the sample under investigation. Therefore, I have developed a new approach to detect the change of the plasmon signal. Instead of employing the spectral information, I switched to use intensity changes at a fixed wavelength. The detection of intensities simplifies the setup, allows for time- and spatial resolution, and extends the range of sensors for dark-field microscopy since the method is independent of resonance phenomena. I have emphasized these advantages by obtaining previously inaccessible information on long time scales, visualizing dynamic processes of molecular interactions with plasmonic nanosensors, and made out-of-resonance dielectric nanoparticles accessible for dark-field microscopy. I have shown that intensity changes are suited for measuring the adsorption of macromolecules on nanoparticles with the advantage of reducing the overall measurement time up to a factor of two. I also derived new quantities to describe the plasmon sensitivity in such an intensity scheme, which distinguishes between the various contributions: Rayleigh scattering, dielectric contrast, plasmon shift, and frequency-dependent plasmon bulk damping. The sensitivity parameters, intensity bulk sensitivity SI and intensity surface sensitivity ŞI, allow characterizing and optimizing the sensor's performance. Furthermore, I found that the basic description of the figure of merit (FOM) underestimates the nanoparticles' performance below the interband transition. To highlight that plasmonic nanoparticles serve as label-free sensors for visualizing dynamic processes, I investigated the Min system, and I observed that on long time scales (24 hours) the wave pattern, the oscillation period and the synchronization of the wave highly depend on the membrane composition. Such data was previously not accessible because commonly used fluorescence labels are not photostable, thus, limiting the observation time. In addition, the intensity-based readout allows utilizing out-of-resonance nanoparticles as sensing elements that have not been addressed so far. I showed in a systematic study that out-of-resonance nanoparticles are similar in their performance in comparison to the commonly used gold nanorods. This new class of sensors for dark-field microscopy has the advantage that the nanosensors can be made out of any transparent material, e.g. many oxides, lipid vesicles, or polymer beads, making studies of biological macromolecules, such as the formation of a protein corona, easier to access.

Die Einzelpartikel-Dunkelfeldmikroskopie ermöglicht die Untersuchung molekularer Wechselwirkungen und die Messung dynamischer Prozesse. Allerdings stellt das synchrone Messen einer großen Anzahl von Nanopartikeln bei einer gleichzeitig hohen Zeitauflösung noch eine Herausforderung dar, welche die Anwendbarkeit der Methode für Proben mit räumlich-zeitlicher Heterogenität begrenzt. Daher habe ich in dieser Arbeit einen neuen Ansatz entwickelt, um die Veränderung des Plasmonensignals zu detektieren. Anstatt wie üblich die spektrale Information hierfür als Maß zu verwenden, bin ich dazu übergegangen, Intensitätsänderungen bei einer festen Wellenlänge zu nutzen. Die Detektion von Intensitäten vereinfacht den Messaufbau, ermöglicht eine zeitliche und räumliche Auflösung und erweitert die Bandbreite einsetzbarer Sensoren für die Dunkelfeldmikroskopie, da die Methode unabhängig von Resonanz-Phänomenen ist. Ich habe diese Vorteile hervorgehoben und bisher unzugängliche Informationen auf langen Zeitskalen erhalten, dynamische Prozesse mit plasmonischen Nanopartikeln abgebildet und nicht-resonante dielektrische Nanopartikel als Sensoren für die Dunkelfeldmikroskopie verwendet. Ich habe gezeigt, dass sich Intensitätsänderungen, die durch die Adsorption von Makromolekülen verursacht werden, zur Messung von Plasmonenverschiebungen eignen mit dem Vorteil, dass die Messdauer um bis zu einem Faktor zwei reduziert werden kann. Ich habe auch neue Parameter zur Beschreibung der Plasmonensensitivität in einem solchen Intensitätsschema hergeleitet, die zwischen den verschiedenen Beiträgen unterscheiden: Rayleigh-Streuung, dielektrischer Kontrast, Plasmonenverschiebung und frequenzabhängige Plasmonendämpfung. Die Sensitivitätsgrößen, Intensitäts-Umgebungs-Empfindlichkeit SI und die Intensitäts-Oberflächen-Empfindlichkeit ŞI, erlauben es, die Leistung des Sensors zu charakterisieren und zu optimieren. Außerdem habe ich festgestellt, dass die grundlegende Beschreibung der Gütezahl (engl. figure of merit, FOM) die Leistung der Nanopartikel unterhalb des Interbandübergangs als zu gering bewertet. Um zu verdeutlichen, dass plasmonische Nanopartikel als markierungsfreie Sensoren zur Visualisierung dynamischer Prozesse verwendet werden können, habe ich das Min-System untersucht und gezeigt, dass auf langen Zeitskalen (24 Stunden) das Wellenmuster, die Oszillationsperiode und die Synchronisation der Welle stark von der Membranzusammensetzung abhängen. Solche Daten waren bisher nicht zugänglich, weil die üblicherweise verwendeten Fluoreszenzmarker nicht photostabil sind und daher die Beobachtungszeit einschränken. Darüber hinaus ermöglicht die intensitätsbasierte Auslesung die Verwendung von nicht-resonanten dielektrischen Nanopartikeln als neue und bisher ungenutzte Sensorelemente. Ich habe in einer systematischen Studie gezeigt, dass die Leistung dieser Nanosensoren mit jener der üblicherweise verwendeten Goldanostäbchen vergleichbar ist. Diese neue Klasse von Sensoren für die Dunkelfeldmikroskopie hat den Vorteil, dass die Nanosensoren aus jedem transparenten Material hergestellt werden können, z.B. aus vielen Oxiden, Lipidvesikeln oder Polymerkügelchen, wodurch Untersuchungen von biologischen Makromolekülen, wie die Bildung einer Proteinkorona, leichter zugänglich werden.