Designing chemical reaction networks for self-regulating colloidal assemblies and DNA delivery applications

Abstract

Biological self-assemblies for e.g., microtubules regulate in space and time via kinetically controlled reaction networks, feedback loops, and energy dissipation giving rise to non-equilibrium processes. Such structures provide an interesting approach for the development of artificial self-assembling molecular systems and materials functions. Early examples of synthetic out-of-equilibrium self-assemblies primarily include supramolecular systems that form transient gels, polymers, vesicles, and micelles. Colloids are rarely used as building blocks. However, they can give rise to functional materials with unique catalytic, photonic, magnetic, and electronic properties originating not only from the positional or dimensional order of the building blocks, but also from the type of material bulk (metallic, polymeric, semiconductor, inorganic). Employing biocompatible material for their fabrication can even pave the way into biomedical applications such as drug delivery and diagnostics. They can even serve as model systems to elucidate physical concepts underlying out-of-equilibrium biological self-assemblies. The research of this thesis aims at developing new concepts for transient colloidal co-assemblies by either coupling or integrating micron-sized colloidal particles to chemical reaction networks (CRNs) of different origins. CRNs are composed of antagonistic activation and deactivation pathways decoupled by either chemical modulation, temporal modulation, or by energy dissipation strategy (reminiscent of biological self-assemblies). The activation pathway induces the formation of assembled structures that are subsequently degraded by the deactivation pathway giving the transient structures a limited lifetime. The kinetics of the antagonistic pathways are tunable and can be tuned to further modulate the lifetime and structural properties of the transient assemblies. Two major challenges addressed in this thesis to achieve successful transient assembly of colloids are: (i) time-dependency of interparticle potentials and (ii) matching the dynamics of micron-sized particles with kinetics of CRNs. Both conditions are indispensable to target transient structures without the system falling into kinetic traps. Within the framework of this thesis, three main design strategies are established to program transient co-assemblies of micron-scale colloids. In the first part of the thesis, a pair of pH-responsive, hetero-complementary colloids are integrated within a pH-feedback system (pH-FS) wherein an alkaline trigger facilitates transient assemblies and autonomous acid formation via an enzymatic cascade subsequent leads to disassembly. The system features advanced chemo-structural feedback where co-assemblies (structures) accelerate their own destruction (negative feedback). To increase the programmability and modularity of transient assemblies, the second part of the thesis makes use of DNA-based networks such as toehold-mediated DNA strand displacement (TMDSD) reaction networks. A TMDSD reaction cascade directs two different colloids into transient co-assemblies. The colloids are functionalized with DNA and become an integral part of the network. The particles transduce two orthogonally different DNA trigger strands to transiently introduce a linker which brings two colloids together into co-assemblies. The system follows a complex trajectory passing through a transient state in the middle and ultimately reaching thermodynamic equilibrium. Although dynamic, the system operates under non-dissipative conditions as it resides in a new state (lowest energy state) and the original state cannot be acquired. The modularity of the design allows the installation of delay phases and accelerators by interconnecting modules to the upstream and downstream of the core network. Moving away from the thermodynamically driven classic TMDSD reactions, the third part of the thesis deals with ATP-fueled enzymatic TMDSD reaction cascade which operates under dissipative conditions. The ATP-powered ligation and restriction of DNA components transiently generates a linker strand at the molecular level which temporally controls the downstream co-assembly of colloids. The resetting ability of the network restores the original state of the system and allows the system to be reused for subsequent cycles. Because of their high robustness, ATP-fueled reaction networks are also installed in the extracellular medium of HeLa cells (cancer cells) to develop a DNA delivery system. The delivery mechanism proposed holds potential applications in gene therapy and gene silencing where therapeutic oligonucleotides such as small interfering RNA (siRNA) and micro RNA (miRNA) can be selectively delivered to target cells and tissues in response to ATP. In a future perspective, strategies developed in this thesis for the fabrication of transient colloidal assemblies represent a step towards functional materials. The design principles can be extended to colloids of different origins, depending on the type of material or application they are targeted at. The modularity of CRNs. especially DNA-based networks, allows the insertion of additional feedback loops to achieve advance dynamic functionalities such as oscillations and bistability.

Biologische Selbst-assemblierungen, wie beispielsweise Mikrotubuli, regulieren im Raum und in der Zeit über kinetisch gesteuerte Reaktionsnetzwerke, Rückkopplungsschleifen und Energieabgabe, was zu nichtgleichgewichtigen Prozessen führt. Solche Strukturen bieten einen interessanten Ansatz für die Entwicklung künstlicher selbstassemblierender molekularer Systeme und Materialfunktionen. Frühe Beispiele für synthetische Nichtgleichgewichts-Selbst-assemblierungen umfassen hauptsächlich supramolekulare Systeme, die vorübergehende Gele, Polymere, Vesikel und Mizellen bilden. Kolloide werden selten als Bausteine verwendet. Sie können jedoch funktionale Materialien mit einzigartigen katalytischen, photonischen, magnetischen und elektronischen Eigenschaften hervorbringen, die nicht nur aus der räumlichen oder dimensionalen Anordnung der Bausteine resultieren, sondern auch aus dem Typ des Materialbulks (metallisch, polymer, halbleitend, anorganisch). Die Verwendung biokompatibler Materialien für ihre Herstellung kann sogar den Weg in biomedizinische Anwendungen wie Arzneimittelabgabe und Diagnostik ebnen. Sie können sogar als Modellsysteme dienen, um die physikalischen Konzepte hinter nichtgleichgewichtigen biologischen Selbst-assemblierungen zu klären. Das Forschungsziel dieser Dissertation besteht darin, neue Konzepte für vorübergehende kolloidale Co-Selbst-assemblierungen zu entwickeln, indem mikroskopische kolloidale Partikel entweder an chemische Reaktionsnetzwerke (CRNs) unterschiedlicher Herkunft gekoppelt oder integriert werden. CRNs bestehen aus antagonistischen Aktivierungs- und Deaktivierungswegen, die entweder durch chemische Modulation, zeitliche Modulation oder durch eine Energieabgabestrategie (analog zu biologischen Selbst-assemblierungen) voneinander getrennt sind. Der Aktivierungsweg führt zur Bildung assemblierter Strukturen, die anschließend durch den Deaktivierungsweg abgebaut werden, wodurch den vorübergehenden Strukturen eine begrenzte Lebensdauer verliehen wird. Die Kinematik der antagonistischen Wege ist einstellbar und kann weiter moduliert werden, um die Lebensdauer und strukturellen Eigenschaften der vorübergehenden Assemblierungen zu beeinflussen. Zwei Hauptprobleme, die in dieser Dissertation angegangen werden, um eine erfolgreiche vorübergehende Assemblierung von Kolloiden zu erreichen, sind: (i) die zeitabhängigen Wechselwirkungspotenziale zwischen den Partikeln und (ii) die Anpassung der Dynamik der mikroskopischen Partikel an die Kinematik der CRNs. Beide Bedingungen sind unerlässlich, um vorübergehende Strukturen zu erreichen, ohne dass das System in kinetische Fallen gerät. Im Rahmen dieser Dissertation werden drei Hauptkonstruktionsstrategien etabliert, um vorübergehende Co-Assemblierungen von mikroskopischen Kolloiden zu programmieren. Im ersten Teil der Dissertation sind ein Paar pH-responsive, heterokomplementäre Kolloide in ein pH-Rückkopplungssystem (pH-FS) integriert, bei dem ein basischer Auslöser vorübergehende Assemblierungen und die autonome Bildung von Säure durch eine enzymatische Kaskade zur anschließenden Disassemblierung ermöglicht. Das System zeichnet sich durch eine fortgeschrittene Chemostruktur-Rückkopplung aus, bei der Co-Assemblierungen (Strukturen) ihre eigene Zerstörung beschleunigen (negative Rückkopplung). Um die Programmierbarkeit und Modularität vorübergehender Assemblierungen zu erhöhen, nutzt der zweite Teil der Dissertation DNA-basierte Netzwerke wie das toehold-vermittelte DNA-Strangverdrängungsreaktionsnetzwerk (TMDSD). Eine TMDSD-Reaktionskaskade lenkt zwei verschiedene Kolloide in vorübergehende Co-Assemblierungen. Die Kolloide sind mit DNA funktionalisiert und werden ein integraler Bestandteil des Netzwerks. Die Partikel übertragen zwei orthogonal unterschiedliche DNA-Auslösestränge, um vorübergehend einen Verbindungsdraht einzuführen, der zwei Kolloide zu Co-Assemblierungen zusammenführt. Das System folgt einer komplexen Bahn, die durch einen vorübergehenden Zustand in der Mitte verläuft und letztendlich das thermodynamische Gleichgewicht erreicht. Obwohl dynamisch, arbeitet das System unter nicht-dissipativen Bedingungen, da es sich in einem neuen Zustand (niedrigster Energiezustand) befindet und der ursprüngliche Zustand nicht wiederhergestellt werden kann. Die Modularität des Designs ermöglicht die Installation von Verzögerungsphasen und Beschleunigern, indem Module mit dem Kernnetzwerk nach oben und unten verbunden werden. Im dritten Teil der Dissertation wird von den thermodynamisch getriebenen klassischen TMDSD-Reaktionen abgewichen und sich mit einer ATP-betriebenen enzymatischen TMDSD-Reaktionskaskade beschäftigt, die unter dissipativen Bedingungen arbeitet. Die ATP-betriebene Verknüpfung und Restriktion von DNA-Komponenten erzeugt vorübergehend einen Verbindungsdraht auf molekularer Ebene, der die nachfolgende Co-Assemblierung von Kolloiden zeitlich steuert. Die Rücksetzfähigkeit des Netzwerks stellt den ursprünglichen Zustand des Systems wieder her und ermöglicht die Wiederverwendung des Systems für nachfolgende Zyklen. Aufgrund ihrer hohen Robustheit werden ATP-betriebene Reaktionsnetzwerke auch im extrazellulären Medium von HeLa-Zellen (Krebszellen) installiert, um ein DNA-Liefersystem zu entwickeln. Der vorgeschlagene Liefersystemmechanismus hat Potenzialanwendungen in der Gentherapie und Gen-Silencing, bei denen therapeutische Oligonukleotide wie small interfering (siRNA) und micro RNA (miRNA) selektiv an Zielzellen und -gewebe in Reaktion auf ATP geliefert werden können. In einer zukünftigen Perspektive repräsentieren die in dieser Dissertation entwickelten Strategien für die Herstellung vorübergehender kolloidaler Assemblierungen einen Schritt hin zu funktionalen Materialien. Die Gestaltungsprinzipien können auf Kolloide unterschiedlicher Herkunft ausgeweitet werden, abhängig von der Art des Materials oder der Anwendung, auf die sie abzielen. Die Modularität von CRNs, insbesondere DNA-basierten Netzwerken, ermöglicht die Einfügung zusätzlicher Rückkopplungsschleifen, um fortgeschrittene dynamische Funktionalitäten wie Oszillationen und Bistabilität zu erreichen.