Netzwerke von Nervenzellen auf strukturierten Oberflächen charakterisiert mit optischen und elektrophysiologischen Methoden

Abstract

Das Wachstum von Nervenzellen und deren Verbindungen im zentralen und peripheren Nervensystem wird durch Proteine der extrazellulären Matrix kontrolliert. In dieser Arbeit wurde das Matrixprotein Laminin verwendet, um Netzwerke von Nervenzellen auf künstlichen Substraten in vitro zu erzeugen. Zu diesem Zweck wurden Lamininstrukturen mit Mikrostempeln aus Polydimethylsiloxan auf Zellkultursubstrate übertragen. Die Mikrostempel wurden in einem mehrstufigen Verfahren durch Abformung von photolithographisch hergestellten Masken angefertigt. Nach Vorversuchen mit neuronal differenzierten Zellen der Zellinien MzN und P19 zur Identifizierung geeigneter Abmessungen der Mikrotrukturen, gelang die Realisierung von Linien- und Gitternetzwerken sowie von komplexeren Schaltungen. Eine morphologische Charakterisierung der erzeugten Netzwerke erfolgte durch Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie.Elektrophysiologische Messungen wurden mit der Patch-Clamp Technik an einer Kultur von Nervenzellen aus primär isolierten Hirnschnitten durchgeführt. Der Erhalt des intakten Zellverbundes im Hirnschnitt sollte Bedingungen möglichst nahe zur Situation in vivo schaffen, um die Bildung von Synapsen zu begünstigen. In Patch-Clamp Messungen an bis zu drei Neuronen gleichzeitig, gelang der Nachweis synaptischer Kopplung in strukturierten Netzwerken solcher Hirnschnitt-Kulturen. Sowohl funktionale chemische Synapsen, als auch Ohm'sche Kopplung über Gap-Junctions wurde beobachtet. Es wurde ein elektrisches Kopplungsmodell abgeleitet. Die Signalleitung in den Nervenfasern erfolgt demnach wie in einem zylindrischen, durch die Zellmembran von der Umgebung isolierten Kabel.

Neuronal growth and the formation of neuronal connections in the central and peripherical nervous system is mediated by proteins of the extracellular matrix. In this thesis, the protein laminin was used to guide neuronal growth and to form networks of nerve-cells on artificial substrate surfaces. Microstamps of polydimethylsiloxane were applied to create micropatterns of laminin on cell-culture substrates. These stamps were moulded from photolithographically structured masters.In initial experiments with neuronally differentiated cells of the cell-lines MzN and P19, appropriate structural geometries for a precise control over neuronal growth were identified. Finally, networks of line- and grid-structure and more complex neuronal circuits could be realized. Morphological evaluation of the networks was performed by phase-contrast and fluorescence microscopy.Electrophysiological measurements in networks of neurons grown-out from primary isolated brain-slices were performed. This special culture was choosen to increase the probability of synaptic contacts by conditions close to in vivo. In simultaneous patch-clamp measurements from multiple cells, synaptic connectivity was detected. Functional synaptic coupling and ohmic coupling caused by gap-junctions was observed.Based on the measured data, an electrical coupling model was designed. Signal transmission through the nerve fibers could be described with a homogeneous cylindric cable, isolated by the cell-membrane.