Design, Synthese und Testung von Aziridin-2,3-dicarboxylatbasierten Cysteinprotease-Inhibitoren

Abstract

Teil I: Design, Synthese und Testung Aziridin-2,3-dicarboxylat-basierter Cysteinprotease-Inhibitoren gegen Cathepsin B Das computergestützte, strukturbasierte Wirkstoffdesign von kovalenten Hemmstoffen wird in den letzten Jahren immer wichtiger, allerdings ist es immer noch eine Herausforderung, selektive und effiziente kovalent-wirkende Inhibitoren zu entwickeln. In vielen Fällen zeigen kovalente Wirkstoffe eine höhere Affinität zu ihrem Target als entsprechende nicht-kovalente Hemmstoffe, was zu einem von Vorteil ist, aber auf der anderen Seite das Risiko von off-target-Effekten und Toxizität erhöht. Um die hohe Effizienz kovalenter Inhibitoren optimal ausnutzen zu können, muss ihre Selektivität für das gewünschte Target optimiert werden. Ziel dieser Arbeit war das computergestützte Design, die Synthese und Testung von neuartigen kovalent-irreversiblen Cathepsin B-Inhibitoren, die einen trans-konfigurierten Aziridin-2,3-dicarboxylatbasierten Ring als warhead tragen. Cathepsin B, eine humane Papain-ähnliche Cysteinprotease, ist ein attraktives Target aufgrund seiner Schlüsselrolle bei der Invasion und Metastase von Tumorzellen verschiedener Krebsarten. Der sogenannte occluding loop (His110/His111), ein einzigartiges Strukturelement unter den Papain-ähnlichen Cysteinproteasen soll mittels einer ionischen Wechselwirkung der Carboxylgruppe, die an der Dipeptid-Erkennungseinheit der entwickelten Aziridinylpeptid-Inhibitoren freigesetzt wird, adressiert werden. Untersuchungen der Kristallstrukturen von bekannten Epoxid-basierten Cathepsin B-Inhibitoren, CA074 (pdb: 1QDQ) und CA030 (pdb: 1CSB) waren die Grundlage für das rationale Design und das Molekulare Docking (FlexX/LeadIT) von potentiellen kovalent-irreversiblen Cathepsin B-Inhibitoren. Die peptidische Erkennungseinheit der oben genannten Leitstrukturen, (S)-Pro-(S)-Ile, wurde übernommen und mittels eines Linker-Moleküls mit dem N-Atom des Aziridinrings verknüpft. Die Docking-Berechnungen ergaben verschiedene Bindungsmodi durch Variation des Linker-Moleküls und der Estergruppen am Aziridinring, wobei die selektive, ionische Wechselwirkung zum occluding loop bei vielen Hit-Substanzen vorhergesagt wurde. Eine Auswahl an Hit-Substanzen aus dem Docking wurden im Folgenden synthetisiert und auf ihre Wirksamkeit gegenüber Cathepsin B, Cathepsin L, Rhodesain und Cruzain getestet. Keine der zehn synthetisierten und getesteten Verbindungen hemmt das gewünschte Haupttarget Cathepsin B, womöglich aufgrund der Flexibilität seiner Struktur. Allerdings hemmen zwei Verbindungen, RC69 (R1 = OBn, R2 = OEtPh) und RC75 (R1 = R2 = OEtPh), humanes Cathepsin L und die parasitären CL-ähnlichen Cysteinproteasen, Rhodesain und Cruzain. Rhodesain wird von beiden Zielverbindungen im nanomolaren Bereich gehemmt.

Teil II: Molekulares Docking und Struktur-Wirkungsbeziehungen Leishmania-selektiver Aziridin-2,3-dicarboxylat-basierter Cysteinprotease-Inhibitoren In vorangegangenen Arbeiten unserer Arbeitsgruppe wurde eine Serie an potenten und selektiven Cysteinprotease-Inhibitoren mit einem Aziridin-2,3-dicarboxylat-Ring als warhead entworfen, synthetisiert und als selektive Inhibitoren der parasitären Cathepsin-L ähnlichen Cysteinprotease LmCPB2.8 von Leishmania mexicana identifiziert. Parasitäre und humane Cathepsin-L ähnliche Cysteinproteasen sind sich strukturell sehr ähnlich, sodass die Herausforderung in der Selektivitätsteigerung der entwickelten Inhibitoren bestand. Das Ziel dieser Arbeit war es, Struktur-Wirkungsbeziehungen mithilfe von computergestützten Verfahren wie Homology Modelling (MOE2015, da für die LmCPB2.8 noch keine Krsitallstruktur vorhanden ist) und Molekularem Docking (FlexX/LeadIT) zur Vorhersage der Bindungsposen in Cruzain und LmCPB2.8 aufzustellen. Die S2-Bindetasche der LmCPB2.8 scheint im Gegensatz zu Cruzain sterisch anspruchsvollere, lipophile Estergruppen zu tolerieren. Die Überlagerung der Aminosäure-Sequenzen der beiden Enzyme zeigt einen signifikanten Unterschied in der S2-Bindetasche aufgrund des Vorhandenseins von Tyr209 in LmCPB2.8 anstelle von Glu208 in Cruzain. Desweiteren sagen Docking-Berechnungen eine starke, ionische Wechselwirkung zwischen der freien Carboxylgruppe am Aziridin-Ring und dem positiv-geladenen His263 im katalytischen Zentrum von LmCPB2.8 voraus, was in Übereinstimmung mit den biologischen Daten ist (PF18, LmCPB2.8 (Ki = 0.41 µM; k2nd [M-1 min-1] = 190,569).1 Computergestützte Struktur-Wirkungsbeziehungen dieser Arbeit sind in Übereinstimmung mit den experimentell bestimmten Hemmdaten der Leishmania-selektiven PF-Inhibitoren, sodass diese als Kandidaten zur weiteren Strukturoptimierung dienen können. Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden kürzlich veröffentlicht (Fey P., Chartomatsidou R., Kiefer W., Mottram JC., Kersten C., Schirmeister T., New aziridine-based inhibitors of cathepsin L-like cysteine proteases with selectivity for the Leishmania cysteine protease LmCPB2.8. Eur J Med Chem 2018, 156, 587-597).