Targeted chromosome shredding to explore X chromosome aneuploidies in aging

Abstract

Aging is characterized by a gradual decline in cellular functions, and growing evidence shows that it does not affect men and women equally. Although women live, on average, five years longer than men, they often experience poorer health overall. Many age-associated diseases display sex biases. One contributing factor is the sex chromosome complement. Male mammals carry one X and one Y chromosome, whereas females possess two X chromosomes, one of which is largely transcriptionally inactivated, though some genes escape silencing. These escaper genes contribute to female resilience, yet their misregulation can also increase disease susceptibility. Notably, female cells with different X chromosome aneuploidies accumulate with age, with the preferential loss of the inactive X the most common. The causal relationship between X chromosome loss and aging remains unknown, and the immediate cellular consequences upon X chromosome loss are largely unexplored. This work reports the first successful derivation and characterization of C3H/Bl6 hybrid mouse embryonic stem cells. Both male and female C3H/Bl6 cells express pluripotency markers, with only a minor differentiation bias toward the germ layers. The differentiation potential of these cells was evaluated through random differentiation into embryoid bodies, which expressed markers of all lineages; however, fewer beating cardiomyocyte-like structures were observed in embryoid bodies derived from female cells. Immunostainings confirmed the presence of cell types from all three germ layers. Analysis of X chromosome dynamics during the differentiation of female cells into epiblast-like stem cells showed that X chromosome silencing occurred progressively over seven days, following a heterogenous yet overall consistent kinetics. Genome editing in the C3H/Bl6 background proved challenging and yielded low efficiencies. Nevertheless, we established a cellular system enabling allele-specific chromosome targeting and shredding in female hybrid cells. The system was activated through Cre recombinase delivery via baculovirus. We found that segmental aneuploidies of the targeted X chromosome constituted the predominant outcome, followed by complete X chromosome loss. Evidence of genomic instability was also observed, with a small proportion of cells exhibiting micronuclei containing X chromosome fragments. Overall, we established a chromosome targeting and shredding system in bona fide C3H/Bl6 hybrids mouse embryonic stem cells. We demonstrated that generating X chromosome aneuploidies is feasible, with chromosome segmentation representing the primary event. This tool provides a foundation to dissect the causal relationship of sex chromosome loss and aging. In addition, these hybrid cells are a valuable model for studying stem cell biology, X chromosome dynamics and sex differences.

Altern ist durch einen allmählichen Rückgang zellulärer Funktionen gekennzeichnet, und immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass Männer und Frauen davon nicht gleichermaßen betroffen sind. Obwohl Frauen im Durchschnitt fünf Jahre länger leben als Männer, weisen sie häufig eine insgesamt schlechtere Gesundheit auf. Viele altersassoziierte Erkrankungen zeigen Geschlechtsunterschiede. Ein Faktor der dazu beiträgt sind die Geschlechtschromosomen. Männliche Säugetiere besitzen ein X- und ein Y-Chromosom, während weibliche Säugetiere zwei X-Chromosomen aufweisen, von denen eines größtenteils transkriptionell inaktiviert ist - wenngleich einige Gene dieser Inaktivierung entgehen. Diese Escaper-Gene tragen zur Resilienz von Frauen bei, doch ihre Fehlregulation kann auch die Anfälligkeit für Krankheiten erhöhen. Bemerkenswerterweise häufen sich mit dem Alter weibliche Zellen mit unterschiedlichen X- Chromosomenvarianten an, einschließlich eines bevorzugten Verlusts des inaktiven X. Die kausale Beziehung zwischen dem Verlust des X-Chromosoms und dem Alterungsprozess ist bislang unbekannt, und die unmittelbaren zellulären Folgen eines solchen Verlusts sind weitgehend unerforscht. Diese Arbeit beschreibt die erste erfolgreiche Etablierung und Charakterisierung von C3H/Bl6-Hybrid-Maus-embryonalen Stammzellen. Sowohl männliche als auch weibliche C3H/Bl6-Zellen exprimieren Pluripotenzmarker und zeigen nur eine geringe Differenzierungspräferenz hin zu den Keimblättern auf. Das Differenzierungspotenzial dieser Zellen wurde durch eine zufällige Differenzierung in Embryoid Bodies untersucht, die Marker aller Zelllinien exprimierten; jedoch wurden in Embryoid Bodies, die aus weiblichen Zellen stammten, weniger schlagende, kardiomyozytenähnliche Strukturen beobachtet. Immunfärbungen bestätigten das Vorhandensein von Zelltypen aller drei Keimblätter. Die Analyse der X- Chromosomendynamik während der Differenzierung weiblicher Zellen zu epiblast-ähnlichen Stammzellen zeigte, dass die X-Chromosomen-Inaktivierung über einen Zeitraum von sieben Tagen schrittweise erfolgte, wobei sie heterogen, aber insgesamt konsistent verlief. Genome Editing im C3H/Bl6-Hintergrund erwies sich als anspruchsvoll und zeigte geringe Effizienzen. Dennoch etablierten wir ein zelluläres System, das allelspezifisches Chromosomen- Targeting und -Shredding in weiblichen Hybridzellen ermöglicht. Das System wurde durch die Einbringung einer Cre-Rekombinase über Baculoviren aktiviert. Wir stellten fest, dass segmentale Aneuploidien des anvisierten X-Chromosoms die häufigste Konsequenz waren, gefolgt vom vollständigen Verlust des X-Chromosoms. Hinweise auf genomische Instabilität wurden ebenfalls beobachtet, wobei ein kleiner Teil der Zellen Mikronuklei mit Fragmenten des X-Chromosoms aufwiesen. Zusammenfassend etablierten wir ein System zum Targeting und Shredding von Chromosomen in bona fide C3H/Bl6-Hybrid-Maus-embryonalen Stammzellen. Wir zeigten, dass die Erzeugung von X-Chromosomen-Aneuploidien möglich ist, wobei Chromosomensegmentierungen das primäre Resultat darstellen. Dieses Werkzeug bildet eine Grundlage zur Untersuchung des kausalen Zusammenhangs zwischen dem Verlust von Geschlechtschromosomen und dem Alterungsprozess. Darüber hinaus stellen diese Hybridzellen ein wertvolles Modell für die Erforschung der Stammzellbiologie, der X-Chromosomendynamik und der Geschlechtsunterschiede dar.