Control of aberrant TDP-43 phase transitions by the selective autophagy machinery

Abstract

Neurodegenerative diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD) converge on the failure of neuronal proteostasis. A central hallmark of these diseases is the cytoplasmic aggregation of TAR DNA binding protein of 43 kDa (TDP-43), a ubiquitously expressed RNA-binding protein whose physiological role in RNA processing and stress responses is essential for neuronal health. How cells normally surveil and clear aberrant TDP-43 assemblies, and how this fails in disease, remains insufficiently understood. In the first part of this thesis (Part A), I investigated how proteasome dysfunction precipitates TDP-43 pathology and how the cell responds to such assemblies. Using stable cell lines expressing GFP-tagged TDP-43 variants, I found that acute proteasome inhibition rapidly drives the condensation of cytosolic TDP-43, in particular C-terminal fragments (CTFs) of TDP-43, into liquid-like puncta that progressively “age” into undynamic aggregate-like structures that become partially detergent-insoluble and acquire hallmarks of pathological TDP-43 inclusions, such as ubiquitination and S409/410 phosphorylation. TDP-43 CTF condensates induced by proteasome inhibition were distinct from stress granules or aggresomes, indicating a unique condensation pathway intrinsic to TDP-43 CTFs. Live-cell experiments revealed that these assemblies are not irreversible endpoints but can be cleared upon washout of the proteasome inhibitor. Their clearance required both Hsp70 chaperone activity, which likely fragments and remodels TDP-43 aggregates, and the autophagy–lysosome system, which engulfs and degrades them. Functional perturbations uncovered distinct contributions: p62/SQSTM1 promotes TDP-43 CTF condensate formation by clustering ubiquitylated TDP-43 species, whereas WIPI2 is essential for phagophore initiation and TDP-43 CTF clearance. Proximity proteomics mapped this sequence of events at molecular resolution, revealing a state-dependent hand-off: diffuse TDP-43 CTF species engage the proteasome, while condensed intermediates recruit autophagy factors including p62, NBR1, WIPI2, and VCP. Immunohistochemistry in FTLD-TDP brain tissue confirmed p62 co-localizes with TDP-43 inclusions and revealed NBR1 as a new aggregating protein in FTLD-TDP patients, underscoring the disease relevance of this pathway. Together, Part A establishes that proteasome failure is sufficient to trigger a regulated condensation of TDP-43, and that successful resolution depends on a coordinated chaperone–autophagy program. In the second part of this thesis (Part B), I examined the role of UBQLN2, a proteostasis factor genetically linked to ALS/FTD. I optimized its purification and demonstrated that UBQLN2 enhances RNA binding of both TDP-43 and FUS and modulates FUS phase separation behavior. These findings suggest that UBQLN2 might have a dual protective role: stabilizing the RNA-bound state of RNA-binding proteins to raise the threshold for aberrant condensation, and routing ubiquitylated clients toward degradation once condensates form. Disease-linked UBQLN2 mutations may impair both protective mechanisms, thereby accelerating the accumulation of pathological TDP-43 and FUS assemblies. Taken together, this work outlines a mechanistic framework that helps to explain how TDP-43 pathology emerges from proteasome dysfunction and progresses through a liquid-to-amorphous trajectory that can still be cleared if chaperones and autophagy engage efficiently. It also positions UBQLN2 as a critical modulator at the intersection of phase behavior and proteostasis routing. These insights highlight key molecular checkpoints: proteasomal throughput, chaperone licensing, and autophagic capture, where therapeutic interventions could possibly reinforce proteostasis mechanisms and thus delay disease progression in ALS and FTD

Neurodegenerative Erkrankungen wie Amyotrophic lateral scleorosis (ALS) und Frontotemporal Dementia (FTD) konvergieren auf dem Versagen der neuronalen Proteostase. Ein zentrales Kennzeichen dieser Erkrankungen ist die zytoplasmatische Aggregation des TAR-DNA-binding Protein of 43 kDa (TDP-43), eines ubiquitär exprimierten RNA-bindenden Proteins, dessen physiologische Rolle in der RNA-Prozessierung und in Stressantworten für die neuronale Gesundheit essenziell ist. Wie Zellen normalerweise fehlerhafte TDP-43-Assemblies überwachen und beseitigen und wie dieser Prozess in der Krankheit fehlschlägt ist bislang nur unzureichend verstanden. Im ersten Teil dieser Dissertation (Teil A) habe ich untersucht, wie eine Proteasom-Dysfunktion TDP-43-Pathologie auslöst und wie die Zelle auf solche Assemblies reagiert. Mithilfe stabiler Zelllinien, die GFP-markierte TDP-43-Varianten exprimieren, konnte ich zeigen, dass eine akute Proteasom-Inhibition rasch zur Kondensation von zytosolischem TDP-43, insbesondere C-terminalen Fragmenten (CTFs) von TDP-43, in „liquid-like“ Punktate führt, die sich schrittweise zu undynamischen, aggregatähnlichen Strukturen „verfestigen“. Diese werden teilweise detergens unlöslich und weisen charakteristische Merkmale pathologischer TDP-43-Inklusionen auf, darunter Ubiquitinierung und Phosphorylierung an S409/410. Durch Proteasom-Inhibition induzierte TDP-43-CTF-Kondensate unterschieden sich sowohl von Stress granula als auch von Aggresomen und zeigten damit einen eigenständigen Kondensationsweg, der den TDP-43-CTFs spezifisch ist. Live-Cell-Experimente belegten, dass es sich hierbei nicht um irreversible Endpunkte handelt, sondern dass diese Assemblies nach Absetzen des Proteasom-Inhibitors wieder abgebaut werden können. Ihr Abbau erforderte sowohl die Aktivität des Hsp70-Chaperons, das vermutlich TDP-43-Aggregate fragmentiert und umgestaltet, als auch das Autophagie–Lysosom-System, das sie umschließt und abbaut. Funktionelle Störungen verdeutlichten dabei unterschiedliche Beiträge: p62/SQSTM1 fördert die Bildung von TDP-43-CTF-Kondensaten durch Clustering ubiquitinierter TDP-43-Varianten, während WIPI2 für die Initiierung des Phagophors und die Clearance von TDP-43-CTFs essenziell ist. Proximity-Proteomic zeigte diese Abfolge von Ereignissen auf molekularer Ebene und offenbarte ein zustandsabhängiges „Hand-off“: Diffuse TDP-43-CTF-Varianten interagieren mit dem Proteasom, während kondensierte Zwischenformen Autophagie-Faktoren wie p62, NBR1, WIPI2 und VCP rekrutieren. Immunhistochemie in FTLD-TDP-Gehirngewebe bestätigte, dass p62 mit TDP-43-Inklusionen kolokalisiert, und identifizierte NBR1 als neues aggregierendes Protein in FTLD-TDP-Patienten, was die Krankheitsrelevanz dieses Weges unterstreicht. Zusammengefasst zeigt Teil A, dass Proteasom-Versagen ausreicht, um eine regulierte Kondensation von TDP-43 auszulösen, und dass eine erfolgreiche Auflösung von einem koordinierten Chaperon–Autophagie-Programm abhängt. Im zweiten Teil dieser Dissertation (Teil B) untersuchte ich die Rolle von UBQLN2, eines Proteostase-Faktors, der genetisch mit ALS/FTD verknüpft ist. Ich optimierte die Aufreinigung und konnte zeigen, dass UBQLN2 die RNA-Bindung sowohl von TDP-43 als auch von FUS verstärkt und das Phase Separation Verhalten von FUS moduliert. Diese Befunde deuten darauf hin, dass UBQLN2 eine doppelte Schutzfunktion haben könnte: Zum einen stabilisiert es den RNA-gebundenen Zustand RNA-bindender Proteine, wodurch die Schwelle für aberrante Kondensation erhöht wird, zum anderen leitet es ubiquitinierte Substrate zum Abbau weiter, sobald sich Kondensate gebildet haben. Krankheitsassoziierte UBQLN2-Mutationen könnten beide Schutzmechanismen beeinträchtigen und damit die Akkumulation pathologischer TDP-43- und FUS-Assemblies beschleunigen. Insgesamt zeigt diese Arbeit ein mechanistisches Rahmenmodell, das erklärt, wie TDP-43-Pathologie aus einer Proteasom-Dysfunktion hervorgeht und sich über einen flüssig-zu-amorphen Verlauf entwickelt, die jedoch noch abgebaut werden kann, wenn Chaperone und Autophagie effizient eingreifen. Gleichzeitig positioniert sie UBQLN2 als einen kritischen Modulator an der Schnittstelle zwischen Phasenverhalten und Proteostase-Routing. Diese Erkenntnisse heben zentrale molekulare Kontrollpunkte hervor: Proteasom-Durchsatz, Chaperon-Lizenzierung und autophagische Erfassung, an denen therapeutische Interventionen die Proteostase-Mechanismen verstärken und damit den Krankheitsverlauf bei ALS und FTD verzögern könnten.