Self-assembling peptide nanostructures for controlled cell-material interactions

Abstract

The ability of peptides to self-assemble into complex hierarchical supramolecular structures is the basis for their diverse structural functions in Nature. This inspired researchers to design peptides from bottom-up to employ them as versatile scaffolds for cell-interactive materials in biomedical contexts. An example for applying this concept is utilizing peptide nanofibrils for therapeutic retroviral gene delivery. However, it is difficult to a priori design the bioactivity of a peptide, as even small changes in the peptide’s sequence can drastically impact its self-assembly behavior and physicochemical properties on multiple length scales. The combination of experimental and computational approaches holds great promise to overcome these challenges in the quest for functional materials design for biomedical applications.

This thesis provides fundamental mechanistic insights for the interactions between peptide nanofibrils with cells and viruses together with strategies for peptide materials design in the context of clinical applications. Viral infectivity as a biological readout was chosen not only because of its clinical relevance but also because it offers a relatively simple readout to unravel the multi-parameter, multi-scale challenges for the identification and optimization of biologically active supramolecular peptide assemblies. The investigation of the peptide–cell–material interaction in this work can be divided into four main parts. The thesis begins with (I) optimizing the sequence of the enhancing factor C (EF-C) peptide that binds virions and facilitates gene delivery applications. This is followed by a (II) comprehensive investigation of essential physicochemical features, which are subsequently employed in (III) machine-learning assisted discovery of novel peptides. Finally, (IV) the application of peptides is explored with a focus on translational clinical aspects.

First, a peptide library was established by designing and synthesizing 163 short peptides based on the known infectivity-enhancing self-assembling peptide EF-C. To systematically study the structure-property-activity relationship of the obtained bioactive sequences, a data-mining strategy was applied to correlate various physicochemical, bioinformatic and biological properties of the peptides. Thereby, it was shown that peptides forming µm-sized -sheet-rich aggregates are essential for promoting interactions of retroviruses with cells. These key-properties are also observed in short amyloidal peptides from diverse pathological and functional origin which emphasizes the universality of this requirement. To gain mechanistic insights of the peptide aggregation process and supramolecular fibril formation, molecular dynamics simulations were performed and revealed that fibril–fibril supramolecular networks are observed for non-dynamic, stable fibrils with low solvent accessible surface areas, i.e. high fibril surface hydrophobicity. Within the EF-C based library, peptides with an alternating amphiphilic sequence and a high ratio of hydrophobic amino acids exhibit a strong propensity to form µm-sized aggregates. This sequence pattern proved to be a reliable strategy for optimizing the sequence of EF-C and rationally design novel bioactive peptide fibrils.

Next, a machine learning workflow was performed on the EF-C based library to inverse-engineer de novo minimalistic peptides via continuous vector representations. The conceptual idea behind this approach is that relevant sequence information underlying infectivity enhancement can be extracted and decoded from a higher-dimensional vector space and this information can be applied for the design of new sequences. With this approach, a new sequence space of self-assembling peptides was discovered. The results show that infectivity enhancement is governed by both electrostatic and hydrophobic contributions. As these newly found peptides display unexpected sequences that are not related to the original EF-C peptide, nor the derived peptide library and they were also not found in Nature, this machine-learning approach presents an efficient strategy to discover entirely new self-assembling peptide sequences with aggregation propensity and high bioactivity.

In the next step, these newly acquired insights about the impact of molecular design on aggregation properties were employed to develop biodegradable peptide fibrils suitable for ex vivo clinical applications. Specifically, peptide amphiphiles for viral gene delivery were evaluated. In contrast to the metabolically very stable amyloid-type peptides that contain an alternating amphiphilic sequence pattern, peptide amphiphiles are characterized by their block-type design and flexibility to customize fibril surface properties. By systematically studying a library composed of 35 peptide amphiphiles, it was found that peptide amphiphiles that form small aggregates can promote virus-cell interactions while being biodegradable. Via molecular dynamics simulations it was shown that their aggregation is dependent on the mobility of monomers in fibrils and surface hydrophobicity that is governed by hydrophobicity, flexibility, and order of amino acids within the peptide sequence. The findings from the PA library are well in line with amyloid-type peptides and emphasize the general importance of the key-physicochemical properties for promoting viral infectivity, i.e. positively charged, µm-sized aggregates formed by hydrophobic, -sheet rich structures.

Finally, to showcase how these properties can be effectively harnessed to regulate interactions between fibrils and cells, a photo-decomposable peptide was engineered. The decomposition was achieved by incorporating a photosensitive linker into the peptide backbone that causes fragmentation of the alternating amphiphilic peptide sequence. This, in turn, results in decomposition of the β-sheet ordered supramolecular assembly and loss of its cell-adhesive properties. Due to the external trigger light, this process can be precisely controlled in space and time, allowing the manufacturing of cell-adhesive regions on surfaces.

Overall, the powerful combination of physicochemical and computational methods can circumvent the individual limitations of both approaches. The findings presented in this thesis showcase the bottom-up design and discovery of new functional peptide nanomaterials for biomedical applications.

Die Fähigkeit von Peptiden, sich zu komplexen hierarchischen supramolekularen Nanostrukturen anzuordnen, ist eine wichtige Grundlage für ihre strukturelle und funktionelle Diversität in der Natur. Dies hat die Forschung dazu inspiriert, Peptide nach einem „Bottom-up“ Ansatz zu entwerfen, um sie als vielseitige Gerüststrukturen für zellinteraktive Materialien im biomedizinischen Kontext einzusetzen. Ein Beispiel für die Anwendung dieses Konzepts ist die Verwendung von Peptid-Nanofibrillen für die therapeutische retrovirale Genübertragung. Es ist jedoch eine Herausforderung, die Bioaktivität eines Peptids rational vorherzusagen, da selbst kleine Änderungen in der Peptidsequenz die Selbstassemblierung und physikochemischen Eigenschaften auf verschiedenen Längenskalen drastisch beeinflussen können. Die Kombination von experimentellen und computergestützten Ansätzen ist ein besonders vielversprechender Ansatz, um diese Herausforderungen auf dem Weg zu einem hochentwickelten Materialdesign zu meistern.

In dieser Arbeit werden grundlegende mechanistische Erkenntnisse über die Wechselwirkungen zwischen Peptid-Nanofibrillen mit Zellen und Viren sowie Strategien für das Design von Peptidmaterialien im Zusammenhang mit klinischen Anwendungen vorgestellt. Die Verstärkung der viralen Infektion ist eine biologische Untersuchungsmethode, die nicht nur wegen ihrer klinischen Relevanz gewählt wurde, sondern auch, weil sie eine Multiparameter- und Multiskalendimension für die Identifizierung und Optimierung biologisch aktiver supramolekularer Peptidstrukturen bietet. Die Untersuchung der Interaktionen zwischen Peptiden und Zellen ist in dieser Arbeit in vier Hauptteile gegliedert. Die Arbeit beginnt mit (I) der Optimierung der Sequenz des bekannten Peptids „Enhancing Factor C“ (EF-C), die Viren binden kann und die Genübertragung verstärken kann. Darauf folgt (II) eine umfassende Untersuchung der wesentlichen physikochemischen Merkmale, die anschließend in (III) der durch maschinelles Lernen unterstützten Entwicklung neuer Peptidsequenzen eingesetzt werden. Schließlich wird (IV) die Anwendung von Peptiden mit dem Schwerpunkt auf ihre klinischen Aspekte erforscht. Zunächst wird eine Peptidbibliothek aufgebaut, indem kurze Peptide entworfen und hergestellt werden, die auf Derivaten eines bekannten infektiösitätssteigernden, selbstassemblierenden Peptids EF-C basieren. Um die Struktur-Eigenschafts-Wirkungs-Beziehung der bioaktiven Sequenz systematisch zu untersuchen, wurde eine Data-Mining-Strategie angewandt und verschiedene physikochemische, bioinformatische und infektiösitätssteigernde Eigenschaften von 163 Peptiden charakterisiert. Auf diese Weise wurde herausgefunden, dass es nicht die Fibrillen selbst sondern ihre µm-großen Aggregate sind, die reich an -Faltblatt-Strukturen sind und die Wechselwirkung zwischen Retroviren und Zellen fördern. Diese Schlüsseleigenschaften werden auch bei kurzen amyloiden Peptiden verschiedener pathogener und funktioneller Herkunft beobachtet, was die mögliche Universalität dieser Merkmale unterstreicht. Innerhalb der EF-C-basierten Bibliothek zeigen Peptide mit einer alternierenden amphiphilen Sequenz und einem hohen Anteil an hydrophoben Aminosäuren eine starke Neigung zur Bildung von Aggregaten in µm-Größe. Dieses Sequenzmuster erwies sich als zuverlässige Strategie zur Optimierung der EF-C-Sequenz und zum rationalen Design bioaktiver Peptidfibrillen. Um Einblicke in den mechanistischen Ursprung der µm-großen Aggregation von supramolekularen Fibrillen zu gewinnen, wurden Molekulardynamik Simulationen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass supramolekulare Fibril-Netzwerke bei nicht-dynamischen, stabilen Fibrillen mit geringer lösungsmittelzugänglicher Oberfläche, d.h. hoher Hydrophobizität der Fibrillenoberfläche, beobachtet werden. Als Nächstes wurde der experimentelle Datensatz der EF-C-basierten Bibliothek für einen maschinellen Lernprozess genutzt, um de novo minimalistische Peptide zu entwickeln. Genauer gesagt wurde eine kontinuierliche Vektordarstellung als Ansatz gewählt, um Peptidsequenzen zu abstrahieren. Die konzeptionelle Idee hinter diesem Ansatz ist, dass relevante Sequenzinformationen, die der Steigerung der Infektiosität zugrunde liegen, aus einem höherdimensionalen Vektorraum extrahiert und in neue Sequenzen dekodiert werden können. Auf diese Weise wurde ein neuer Sequenzraum von selbstorganisierenden Peptiden entdeckt, der zeigt, dass die Infektionsverstärkung sowohl durch elektrostatische als auch durch hydrophobe Beiträge bestimmt wird. Diese neu gefundenen Peptide basieren zum Teil auf unerwarteten Sequenzen, die nicht dem Trainingset der ursprünglichen Bibliothek ähneln und nach bestem Wissen auch nicht in der Natur zu finden sind. Dieser Ansatz des maschinellen Lernens stellt also eine hocheffiziente Methode zur Entdeckung völlig neuer bioaktiver, selbstorganisierender Peptide dar. Die klinische ex vivo-Anwendung von EF-C basierten Peptiden wird allerdings durch deren schlechte Bioabbaubarkeit limitiert. Die neu gewonnenen Erkenntnisse über den Einfluss des molekularen Designs auf die Aggregationseigenschaften wurden daher genutzt, um biologisch abbaubare Peptidfibrillen für den viralen Gentransport zu entwickeln. Im Gegensatz zu den nur schwer abbaubaren Peptiden des Amyloid-Typs, die ein alternierendes amphiphiles Sequenzmuster enthalten, zeichnen sich Peptidamphiphile durch ihr blockartiges Design und ihre Flexibilität bei der Anpassung der Oberflächeneigenschaften der Fibrillen aus. Durch die systematische Untersuchung einer Bibliothek von 35 Peptidamphiphilen wurde herausgefunden, dass insbesondere kleine Aggregate die Interaktion zwischen Retroviren und Zellen fördern und gleichzeitig von Zellen effizient abgebaut werden können. Mittels Molekulardynamiksimulationen wurde festgestellt, dass die Aggregation von der Mobilität der Monomere in den Fibrillen und der Oberflächenhydrophobizität abhängt, die wiederum von der Hydrophobizität, der Flexibilität und der Reihenfolge der Aminosäuren innerhalb der Peptidsequenz bestimmt wird. Die Ergebnisse dieser Peptidamphiphil-Bibliothek stimmen gut mit den Peptiden des Amyloid-Typs überein und unterstreichen die allgemeine Bedeutung der physikochemischen Schlüsseleigenschaften, die identifiziert wurden. Für die Förderung der viralen Infektionsverstärkung sind positiv geladene, µm-große Aggregate, die von hydrophoben, β-faltblattreichen Strukturen gebildet werden, essenziell. Schließlich wird gezeigt, dass diese Eigenschaften effektiv genutzt werden können, um die Wechselwirkungen zwischen Fibrillen und Zellen zu regulieren. Dies wird über eine stimulus-responsive Gruppe im Peptidrückgrat erreicht, die eine lichtgetriebene Fragmentierung der alternierenden amphiphilen Peptidsequenz ermöglicht, was schließlich zur Zersetzung des supramolekularen Aufbaus mit β-Faltblattanordnung und zum Verlust der zelladhäsiven Eigenschaften führt. Durch den optischen Trigger kann dieser Prozess räumlich und zeitlich genau gesteuert werden, was die Herstellung von klar definierten zelladhäsiven Oberflächen ermöglicht.

Insgesamt liefert diese Arbeit grundlegende Erkenntnisse und Designstrategien für funktionelle Peptid-Nanomaterialien. Die leistungsstarke Kombination von physikalisch-chemischen und computergestützten Methoden kann die Beschränkungen der jeweils einzelnen Methoden überwinden, um neue Peptidmaterialien für künftige biomedizinische Anwendungen zu entdecken.