Der Einfluss von Sphingomyelin auf die Autophagie in Abhängigkeit von ATG9A und RNA als Autophagiesubstrat

Abstract

Die Makroautophagie/Autophagie stellt einen der wichtigsten, adaptierbaren Degradati-onswege zur Aufrechterhaltung der Zellhomöostase dar. Abzubauendes Material wird in ein doppelmembranöses Vesikel, das Autophagosom, eingeschlossen, welches mit den Lyso-somen fusioniert, damit das im Autophagosom verpackte Substrat abgebaut und die Nähr-stoffe recycelt werden. Autophagosomen werden de novo über eine Vorläuferstruktur, die Phagophore, gebildet. Während des Wachstums wird abzubauendes Substrat, wie bei-spielsweise verschiedene RNA-Typen, in die Phagophore eingeschlossen. Dabei ist die Bil-dung der Autophagosomen stark abhängig von der Lipidverfügbarkeit. Hauptversorger der Phagophore mit Lipiden ist das ER, von dem die Lipidtransferasen ATG2A und ATG2B Lip-ide direkt vom ER an die Phagophore transferieren. Lipidtröpfchen liefern Fettsäuren ins ER für die Synthese verschiedener Membranlipide und sind somit ein indirekter Lipidlieferant. Die Mobilisation der Fettsäuren ist abhängig von RAB18, welches in seiner aktiven Form die Fusion von Lipidtröpfchen und ER unterstützt. Auch andere Zellkompartimente versorgen die Phagophore mit Lipiden. Dazu zählen unter anderem das endosomale System, der Golgi-Apparat und vor allem ATG9A-positive Vesikel. Die ATG9A-positiven Vesikel nehmen dabei eine besondere Funktion ein, da sie nicht nur Lipide und Proteine liefern, sondern selbst als Keim der Phagophore dienen. Außerdem weist ATG9A eine Skramblase-Aktivität auf, die die gleichmäßige Verteilung der Lipide über die Lipiddoppelschicht gewährleistet. Im Zuge dieser Arbeit wurde gezeigt, dass das Membranlipid Sphingomyelin, welches als Bestandteil der autophagosomalen Membran identifiziert wurde, die Autophagie positiv mo-dulierte. Sowohl unter basalen als auch Autophagie-induzierenden Bedingungen steigerte Sphingomyelin die autophagische Aktivität weiter. Diese Modulation war abhängig vom ATG9A-positiven Vesikeltransfer. Der transiente Verlust von ATG9A sowie die Inhibierung des ATG9A-positiven Vesikeltransfer verhinderte eine Modulation der autophagischen Akti-vität durch Sphingomyelin. Ferner modulierte Sphingomyelin die autophagische Aktivität po-sitiv in Knock-Out-Modellen von ATG2A/B und RAB18, in denen die Lipidhomöostase der Zellen stark beeinträchtigt war und die beide durch eine negative autophagische Aktivität charakterisiert waren. Zusätzlich wurde das Isolationsprotokoll für Autophagosomen optimiert und anschließend erstmals RNA aus Autophagosomen isoliert. Es konnte ribosomale RNA sowie die SRP-assoziierte RNA in Autophagosomen nachgewiesen werden, allerdings keine mRNA-Mole-küle und keine nukleäre RNA. Zusammenfassend wurde die Bedeutung von Sphingomyelin für die Synthese und Funk-tion der Autophagosomenmembran verdeutlicht und zudem mit der RNA eine weitere Cargo-Komponente aus Autophagosomen isoliert.

Macroautophagy/autophagy describes a highly adaptive degradative pathway important for eukaryotic cell homeostasis. During autophagy degradable substrates are engulfed in a double membranous vesicle, the autophagosome, that fuses with lysosomes for degradation and recycling of nutrients. Each autophagosome is synthesized de novo via its precursor, the phagophore. During its elongation, the phagophore engulfs different types of substrates, including nucleic acids like the RNA. Since every autophagosome is newly synthesized, the formation is highly dependent on the lipid availability. Main supplier of the phagophore with lipids is the ER, from which lipids are shuttled to the growing phagophore membrane by the lipid transferases ATG2A and ATG2B. Lipid droplets support the synthesis of membrane lipids by the mobilization of fatty acids. RAB18, a small RAB-GTPase, is very important as it works as a tether to support the fusion of Lipid Droplets with the ER and therefore the mobilization of fatty acids. Additionally, other cell compartments like the endosomal system, the Golgi and ATG9A positive vesicles are lipid sources. Especially ATG9A positive vesicles play a crucial role in the formation of the phagophore because they do not only supply lipids and proteins but serve also as a seed for the phagophore. Furthermore, ATG9A is a lipid scramblase and therefore important for the proper distribution of lipids across the membrane leaflets. This work showed now that the membrane lipid sphingomyelin, that was identified as a component of the autophagosomale membrane, positively modulated autophagic activity. Under basal and under autophagy-inducing conditions sphingomyelin was capable enhance autophagic activity further on. This modulation was dependent on ATG9A positive vesicle trafficking. The transient knock-down as well as the impairment of ATG9A positive vesicle trafficking abolished the positive effect of Sphingomyelin on autophagic activity. Further-more, sphingomyelin enhanced autophagic activity in ATG2A/B KO-cells as well as in RAB18 KO-cells, which both showed a negative autophagic activity due to the disturbed cellular lipid homeostasis. Next, the isolation protocol for autophagosomes was optimized and RNA was isolated out of autophagosomes for the first time. Ribosomal RNA and SRP associated RNA were de-tected within autophagosomes, but mRNA and nuclear RNA were excluded. Taken together, the relevance of sphingomyelin in the biogenesis and functionality of au-tophagosomes was pointed out and additional RNA as a further autophagosomal cargo was isolated out of autophagosomes.