Characterization of CCR8+ regulatory T cells in human tumors and healthy tissue

Abstract

Regulatory T (Treg) cells are well known for their immune-regulatory functions, namely restraining excessive inflammation and mediating peripheral tolerance to self- antigens, for which they rely on the transcription factor FOXP3. A highly-activated, effector-like subset of Treg cells can also be found in non-lymphoid tissues. In addition to the immunosuppressive program, this subset further has tissue regenerative properties and is characterized by the expression of the transcription factor BATF and the surface receptor CCR8. While pivotal for maintaining tissue homeostasis, the tissue-regenerative function of Treg cells could be deleterious in the context of cancer. It is still unclear, whether this tissue-specific CCR8+ Treg cell subset can also be found in the tumor microenvironment. In the literature, Treg cells found in tumors, often referred to as “tumor Treg” cells, are described to have a similar phenotype to CCR8+ Treg cells, and efforts are put into therapeutically targeting this cell type. One drawback of the majority of these studies, however, is that Treg cells isolated from the tumor are compared to Treg cells isolated from peripheral blood. This does not allow for the deconvolution of tumor-vs-healthy and lymphoid-vs-non-lymphoid differences. In this study, we performed a molecular characterization with single-cell resolution of human T cells from a variety of healthy tissues, inflamed tissue, and tumors, with the aim of comparing CCR8+ Treg cells from the tumor to their non-lymphoid tissue counterparts as well as other cell types in the tissues. We analyzed chromatin accessibility genome-wide (via single-cell ATAC sequencing) to infer transcriptional programs, as well as gene expression profiles, using single-cell RNA sequencing. Our investigation reveals shared molecular programs in human CCR8+ Treg cells, irrespective of (non-lymphoid) tissue type or disease state (healthy, inflamed, primary tumor, and metastasis). Moreover, CCR8+ Treg cells from tumor did not show significant differences from CCR8+ Treg cells from healthy tissue at the transcriptional level. T cell receptor (TCR) analysis of CCR8+ Treg cells from the tumor and healthy tissue revealed shared clones between the disease states, identifying a clonal relationship. Taken together, our results argue against a special “tumor Treg” cell subset, but rather suggest a common CCR8+ Treg cell type common to the tumor and healthy tissue. This finding calls for caution regarding the development of “tumor Treg” cell- targeting therapies, since the presence of CCR8+ Treg cells in healthy tissue, essential for peripheral tolerance and tissue homeostasis, suggests potential unintended consequences of such interventions.

Regulatorische T Zellen, kurz Treg, sind bekannt für ihre immunregulatorischen Funktionen, z.B. die Begrenzung von übermäßiger Entzündung oder die Vermittlung peripherer Immuntoleranz gegenüber Selbstantigenen. Diese besonderen Eigenschaften werden durch den Transkriptionsfaktor FOXP3 vermittelt. Ein hochaktivierter, Effektor-ähnlicher Subtyp von Treg-Zellen kann aber auch in nicht- lymphoiden Gewebe gefunden werden. Neben dem immunsuppressiven Programm besitzt dieser Subtyp geweberegenerative Eigenschaften und zeichnet sich durch die Expression des Transkriptionsfaktors BATF und des Oberflächenrezeptors CCR8 aus. Obwohl für die Aufrechterhaltung der Gewebshomöostase entscheidend, könnte die geweberegenerative Funktion von Treg-Zellen im Kontext von Krebserkrankungen nachteilig sein. Es ist allerdings immer noch unklar, ob dieser gewebespezifische CCR8+ Treg-Zell Subtyp überhaupt in der Tumormikroumgebung zu finden ist. In der Literatur beschriebene Treg-Zellen aus dem Tumor, oft „Tumor Treg“-Zellen genannt, haben einen ähnlichen Phänotyp wie CCR8+ Treg-Zellen. Basierend auf dieser Literatur werden aktuell Krebstherapien entwickelt, welche auf „Tumor Treg“-Zellen abzielen. Ein Nachteil dieser Studien ist jedoch, dass Treg-Zellen, die aus dem Tumor isoliert wurden, mit Treg-Zellen aus dem peripheren Blut verglichen werden. Dies lässt keine Rückschlüsse darauf zu, welche der beobachteten Unterschiede von der Variablen „Tumor gegen gesund“ und welche von der Variablen „lymphoid gegen nicht-lymphoid“ stammen. In dieser Arbeit haben wir eine molekulare Charakterisierung mit Einzelzellauflösung von humanen T-Zellen aus verschiedenen gesunden Geweben, entzündetem Gewebe und Tumoren durchgeführt, mit dem Ziel, CCR8+ Treg-Zellen aus dem Tumor mit CCR8+ Treg-Zellen aus nicht-lymphoidem Gewebe sowie mit anderen Zelltypen im Gewebe zu vergleichen. Wir haben die genomweite Chromatinverfügbarkeit mithilfe von Einzelzell-ATAC-Sequenzierung analysiert, um transkriptionelle Programme abzuleiten. Außerdem haben wir Genexpressionsprofile anhand von Einzelzell-RNA-Sequenzierung erstellt. Unsere Untersuchung zeigt identische molekulare Programme in menschlichen CCR8+ Treg-Zellen, unabhängig vom (nicht-lymphoidem) Gewebetyp oder Krankheitszustand (gesund, entzündet, primärer Tumor und Metastase). Darüber hinaus zeigten CCR8+ Treg-Zellen aus dem Tumor keine signifikanten Unterschiede zu CCR8+ Treg-Zellen aus gesundem Gewebe auf transkriptioneller Ebene. Die T-Zell-Rezeptor-Analyse von CCR8+ Treg- Zellen aus Tumor und gesundem Gewebe identifizierte außerdem gemeinsame Klone zwischen gesunden und erkrankten Geweben, was Rückschlüsse auf eine klonale Beziehung zwischen Tumor-residenten und nicht-Tumor CCR8+ Treg zulässt. Zusammenfassend sprechen unsere Ergebnisse gegen einen speziellen "Tumor- Treg"-Zell Subtyp, sondern legen eher einen gemeinsamen CCR8+ Treg-Zelltyp nahe, der sowohl im Tumor als auch im gesunden Gewebe vorkommt. Diese Erkenntnis muss bei der Entwicklung von Immuntherapien bedacht werden, die gezielt auf "Tumor Treg"-Zellen abzielen. Diese neuen Therapiemodelle könnten aller Wahrscheinlichkeit nach CCR8+ Treg nicht nur im Tumor, sondern auch in gesunden Geweben vernichten. Da dieser Zelltyp aber für periphere Toleranz und die Gewebshomöostase wichtig ist, könnte dessen systemische Eliminierung unvorhergesehene Nebenwirkungen in gesunden Geweben hervorrufen.