Towards a mechanistic understanding of R-Loop regulation and function at telomeres

Abstract

RNA-DNA-Hybride können bei der Transkription der DNA-Replikation und der Reparatur der DNA durch Basenpaarung von RNA und DNA entstehen. Diese Hybridstrukturen sind wichtige Zwischenprodukte in diesen Prozessen und erfordern eine strenge Regulierung betreffend ihrer Bildung, Lokalisation und ihres Abbaus. RNA-DNA-Hybride sind im gesamten Genom präsent und haben dort regulatorische Funktionen. Beispielsweise regulieren sie die Transkription, die Chromatinstruktur, die DNA-Reparatur und die Erhaltung der Telomere. Eine Fehlregulierung von RNA-DNA-Hybriden kann jedoch die Stabilität des Genoms beeinträchtigen, wobei die Akkumulation pathologischer Hybride zu verschiedenen Krankheiten beiträgt. Telomere sind Nukleoproteinstrukturen an den Enden linearer eukaryotischer Chromosomen, die für die Stabilität und Integrität des Genoms von wesentlicher Bedeutung sind. Eine wichtige Funktion der Telomere ist der Schutz der Chromosomenenden vor deren Degradation. Des Weiteren verhindern sie, dass die Chromosomenenden als DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) erkannt werden, wodurch Chromosomenmutationen und der Verlust genomischer Informationen verhindert werden. An Telomeren transkribiert RNA-Polymerase II die lange nicht-kodierende RNA TERRA (Telomeric repeat-containing RNA), die physiologisch relevante RNA-DNA-Hybride bildet. Sobald die Telomere eine kritische Länge erreichen werden TERRA-RNA-DNA-Hybride stabilisiert, was die Reparatur durch homology directed repair (HDR) auslöst, um den Beginn der replikativen Seneszenz zu verzögern. Wichtig ist, dass sich auch an Telomeren mit langer und mittlerer Länge, an welchen keine HDR stattfindet, vorübergehende TERRA-RNA-DNA-Hybride bilden. Dies deutet darauf hin, dass RNA-DNA-Hybride an Telomeren eine weitere Rolle spielen und nicht ausschließlich zur Förderung der HDR an kritisch kurzen Telomeren erforderlich sind. In dieser Arbeit zeigen wir, dass RNA-DNA-Hybride an nicht mehr funktionsfähigen Telomeren in Saccharomyces cerevisiae die Exo1-vermittelte Resektion verhindern. Dabei wurde das ausführlich charakterisierte cdc13-1 Allel verwendet, bei dem die Telomer-resektion temperaturabhängig induziert werden kann. Mit Hilfe dieses Allels konnten wir zeigen, dass die Akkumulation von RNA-DNA-Hybriden an Telomeren die Letalität und die ssDNA-Akkumulation in cdc13-1-Mutanten verhindern kann. Zusätzlich verschlimmert der Abbau und Destabilisierung von Hybriden durch Überexpression von RNase H1 die Exo1-vermittelte Resektion und beeinträchtigt die Vitalität der Zellen. Darüber hinaus haben RNA-DNA-Hybride an Telomeren keinen offensichtlichen Einfluss auf deren Verkürzungsrate. Insgesamt unterstützen diese Ergebnisse ein Modell, bei dem TERRA-Hybride dynamisch reguliert werden müssen, um die HDR an kurzen Telomeren voranzutreiben. Dabei kann Vorhandensein von RNA-DNA-Hybriden durch Replikationsstress HDR auslösen und ihr Abbau Strangresektion ermöglichen, wodurch die Reparatur erfolgreich abgeschlossen werden kann.