Interferon-γ loaded dextran-based nanoparticles for the polarization of macrophages

Abstract

The immune system, comprising cellular and humoral elements, is crucial in both malignancy progression and regression. Macrophage progenitors develop in the bone marrow and differentiate into various subtypes with diverse target tissues and functions. In the context of malignant tumours, two major subclasses are distinguished: TAMs (Tumour associated macrophages), which resemble the M2 phenotype and tumouricidal proinflammatory M1 macrophages. TAMs contribute to tumour-promoting immunosuppression and vascularization in the tumour microenvironment. This negatively affects primary tumour growth, metastasis, and therapy response. Regarding macrophage differentiation, interferon-γ (IFN-γ) is a potent cytokine to support M1 polarization and is relevant to immunological tumour defence. Nanoparticles can serve as carriers to reduce the side effects of cytokine therapy by enhancing the uptake of the active substance in the target tissue, while sparing unrelated tissues. Dextran nanoparticles (DNPs) are taken up by macrophages in vitro without any toxic impact. In vivo, DNP accumulate mainly in the liver, where they are prominently taken up by macrophages. Until now, the efficacy of interferon-γ (IFN-y) loaded DNPs to induce M1-type polarization/repolarization of TAMs in vitro and a possible therapeutic effect in vivo has not been studied. The aim of this thesis was to study if IFN-γ-DNP affect the polarization of bone marrow derived macrophages of Balb/c and C57BL/6 mice in vitro and whether they have a positive therapeutic effect in a melanoma metastasis model in vivo. Toxicity of IFN-γ-DNP was excluded in in vitro experiments with primary macrophages derived from wild-type mice. Using quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR), the genetic profiles of native and in vitro M2 differentiated macrophages subsequently treated with IFN-γ and IFN-γ-DNP were analysed. Despite different assumptions, both IFN-γ and IFN-γ-DNP required costimulation with lipopolysaccharide (LPS) to significantly increased the expression of tumour necrosis factor α (tnfa), cluster of differentiation 38 (cd38), class II major histocompatibility complex molecules (mhc2),inducible nitric oxide synthase (inos) and lymphocyte antigen 6 complex (ly6c), all M1 marker genes, and upregulated the expression of early growth response protein (egr2) and mannose receptor, cluster of differentiation 206 (cd206/mrc1), both M2 marker genes. Macrophages treated with IFN-γ-DNP and LPS-loaded dextran nanoparticles (LPS-DNP) transcribed significantly more mRNA of specific M1 marker genes and reduced the expression of M2-specific genes compared to macrophages treated with IFN-γ and LPS alone. Therefore, it may be concluded that IFN-γ (IFN-γ-DNP) and LPS have a synergistic effect towards M1-type polarization due to the priming ability of IFN-γ. This effect could be increased with enhanced delivery and uptake of IFN-γ loaded into DNP. Furthermore, an increased metabolic activity due to dextran as an additional source of energy may also contribute. However, empty DNP (eDNP) alone had no polarizing effect. Single IFN-γ-DNP treatment induced an M1 phenotype also as characterized by fluorescence-activated cell sorting (FACS)-analysis showed an increased MHCII and decreased CD206 expression. In contrast, coactivation with LPS was required to detect a significant change in the mRNA expression of mhc2 and mrc1 by qPCR. In addition, the combination of IFN-γ-DNP and LPS, LPS as well as LPS-DNP, led to an increased tumour necrosis factor α (TNFα) production, as determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), while the increased interleukin-10 (previous described as M2-type marker) content in the cell culture supernatant can presumably be explained by an increased production of this cytokine that can occur initially during M1 macrophage polarization. The DNPs were successfully tested for tolerability in a mouse (C57BL/6) model of liver metastasis using B16F10 melanoma cells. Although IFN-γ-DNPs generated a MHCII high CD206 low phenotype in vitro, as detected by FACS, no therapeutic effect was observed in vivo. Treatment with IFN-γ-DNP was neither able to inhibit the growth of liver metastases nor to induce a polarization of macrophages/TAMs in vivo towards a tumouricidal M1 type in healthy or metastatic livers. Based on the observed results, further research may investigate the potential therapeutic effect of longer lived and shielded PEGylated LPS-DNP, especially combined with IFN-γ-DNP, in vitro and in vivo. In conclusion, although IFN-γ-DNP alone did not have a therapeutic anti-tumour effect in vivo, IFN-γ-DNP, particularly in combination with LPS, demonstrated promising results in polarizing and repolarizing bone marrow-derived macrophages to a tumouricidal phenotype in vitro.

Das Immunsystem, bestehend aus humoralen und zellulären Komponenten, spielt eine entscheidende Rolle, sowohl bezüglich des Progresses, als auch des Regresses maligner Tumore. Im Hinblick auf die an der Tumorabwehr beteiligten Immunzellen nehmen Makrophagen eine zentrale Stellung ein. Die Progenitorzellen der Makrophagen entstehen im Knochenmark und zirkulieren in der Blutbahn, bis sie anschließend in die verschiedenen Zielgewebe wandern, um sich dort zu spezialisierten Gewebsmakrophagen zu differenzieren. Im Kontext von bösartigen Tumoren unterscheidet man zwei große Subklassen: Zum einen Tumormakrophagen (TAM: tumor associated macrophages), welche dem M2 Phänotyp ähnlich sind, zum anderen proinflammatorische M1 Makrophagen, die das Tumorwachstum hemmen. TAMs begünstigen entscheidend die tumorfördernde Immunsuppression und Vaskularisierung im Tumormikromillieus, was das primäre Tumorwachstum, die Metastasierung und die Therapieantwort negativ beeinflusst. Die Differenzierung der Makrophagen wird maßgeblich durch das sie umgebende Milieu und die darin enthaltenen Zytokine beeinflusst. Interferon-γ (IFN-γ) ist ein potentes Zytokin, das eine M1 Polarisierung fördert und damit relevant für die immunologische Tumorabwehr ist. Nanopartikel als Transportmedium können die Nebenwirkungen der Zytokintherapie minimieren, indem sie die Aufnahme des Wirkstoffs im Zielgewebe maximieren, während unbeteiligte Gewebe umgangen werden. Es konnte gezeigt werden, dass dextranbasierte Nanopartikel von Makrophagen in vitro ohne jegliche toxische Wirkung aufgenommen werden und sich in vivo vor allem in der Leber anreichern, wo sie ebenfalls hauptsächlich von Makrophagen aufgenommen werden. Die Effektivität IFN-γ-beladener dextranbasierter Nanopartikel (IFN-γ-DNP) eine M1-Typ Polarisierung/Repolarisierung tumorassoziierter Makrophagen in vitro zu induzieren, als auch in vivo einen möglichen therapeutischen Effekt zu erzielen wurde bisher nicht untersucht. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob IFN-γ-DNP die Polarisierung von Makrophagen aus dem Knochenmark von Balb/c- und C57BL/6-Mäusen in vitro beeinflussen und ob sie in einem Melanom-Metastasierungs-Modell in vivo eine positive therapeutische Wirkung haben. IFN-γ-DNP zeigten in vitro keinen toxischen Effekt gegenüber Makrophagen, die aus dem Knochenmark von Wildtyp-Mäusen extrahiert und kultiviert wurden. Mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) wurden die genetischen Profile der nativen und in vitro alternativ (M2) differenzierten und anschließend mit IFN-γ und IFN-γ-DNP behandelten Makrophagen untersucht. Entgegen der Erwartung transkribierten mit IFN-γ und IFN-γ-DNP behandelte Makrophagen nur unter ergänzender Stimulation mit Lipopolysacchariden (LPS) im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant vermehrt M1 spezifischer Marker-Gene, wie den Tumornekrosefaktor α (tnfa), das Cluster of Differentiation 38 (cd38), die Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes der Klasse II (mhc2), die Induzierbaren Stickoxid-Synthase (inos) und den Lymphozyten-Antigen 6-Komplex (ly6c). Early Growth Response Protein (egr2) und Mannose-Rezeptor, Cluster of Differentiation 206 (cd206/mrc1), beide M2 Marker-Gene, wurde vermindert transkribiert. Makrophagen, die mit IFN-γ-DNP und LPS oder LPS tragenden Dextran-Nanopartikeln (LPS-DNP) behandelt wurden, transkribierten signifikant mehr M1 spezifische Gene als die Makrophagen der Referenzgruppe, die nur die von Kombination IFN-γ und LPS erhielten. Daraus lässt sich schließen, dass IFN-γ (IFN-γ-DNP) und LPS, möglicherweise aufgrund der Priming-Fähigkeit von IFN-γ, eine synergistische Wirkung auf die M1-Typ-Polarisierung haben. Die vermehrte Verfügbarkeit und Aufnahme von in DNP gebundenem IFN-γ, verglichen mit ungebundenem IFN-γ, könnte diese Wirkung verstärken. Außerdem scheint die Stoffwechselaktivierung durch die dextranhaltigen Nanopartikel eine Rolle zu spielen, wobei jedoch ungeladene DNP (eDNP) Makrophagen nicht polarisierten. Die Behandlung mit IFN-γ-DNP induzierte einen M1-Phänotyp, der auch durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) charakterisiert wurde - die Analyse zeigte eine erhöhte MHCII- und eine verringerte CD206-Expression. Dagegen war eine Koaktivierung mit LPS erforderlich, um eine signifikante Änderung in der Expression von mhc2 und mrc1 mittels qPCR nachweisen zu können. Die Kombination von IFN-γ-DNP und LPS, sowohl LPS als auch LPS-DNP, führte zu einer erhöhten Produktion von Tumornekrosefaktor α (TNFα), die mittels Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest ((EIA) engl. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)) bestimmt wurde, wohingegen der erhöhte Interleukin-10 Gehalt (vorrangehend als M2-Typ Marker beschrieben) im Zellkulturüberstand vermutlich darauf zurückzuführen, dass auch während der M1-Polarisierung initial eine vermehrte Produktion diese Zytokins auftreten kann. Die Verträglichkeit der DNP wurde erfolgreich in einem Mausmodell (C57BL/6) für Lebermetastasen unter Verwendung von B16F10 Melanomzellen getestet. Obwohl IFN-γ-DNP in vitro einen Phänotypenwechsel (MHCIIhigh, CD206low induzierten, konnte in vivo keine therapeutische Wirkung beobachtet werden. Eine Behandlung mit IFN-γ-DNP konnte weder das Wachstum der Lebermetastasen hemmen, noch in gesunden oder Metastasen-Lebern eine Polarisierung der Makrophagen/TAM in Richtung eines tumorhemmenden M1-Typs erreichen. Basierend auf den beobachteten Ergebnissen könnten weitere Forschungsarbeiten die potenziellen therapeutische Wirkung von langlebigerem und geschütztem PEGyliertem LPS-DNP, insbesondere in Kombination mit IFN-γ-DNP in vitro und in vivo untersuchen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass IFN-γ-DNP allein zwar keine therapeutische anti-tumorale Wirkung in vivo hatte, dennoch IFN-γ-DNP in vitro, insbesondere in Kombination mit LPS, eine Polarisierung und Repolarisierung nativer und M2 differenzierter Makrophagen in Richtung eines tumorkritischen Phänotyps initiierte.