Membran-inserierter pflanzlicher Lichtsammelkomplex LHCII : strukturelle Untersuchungen
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Abstract
Biologische Membranen bestehen in der Regel hauptsächlich aus Phospholipiden. Die pflanzliche Thylakoidmembran ist dagegen zu ~80% aus Lipiden mit ungeladenen Zuckerkopfgruppen (Galaktolipide) zusammengesetzt; den übrigen Teil machen negativ geladene Lipide aus. Der Großteil der Galaktolipide besteht aus MGDG, das aufgrund seiner kegelförmigen Gestalt selbst keine lamellaren Membranstrukturen bilden, jedoch durch Interaktionen mit LHCII-Proteinen in die Thylakoidmembran integriert werden kann. Um die Bedeutung dieser Wechselwirkung für die Struktur des LHCII zu verstehen, wurde in dieser Arbeit zunächst eine Methode entwickelt, das Protein in oberflächengestützte Membranen (SLBs) zu integrieren. Anschließend konnten mithilfe der atomaren Kraftmikroskopie (AFM) einzelne Komplexe aus den SLBs herausgezogen und damit die LHCII- Polypeptidstruktur schrittweise mechanisch denaturiert werden. Der LHCII wies dabei kein klar strukturiertes Entfaltungsmuster auf, da jede der zahlreichen Pigmentbindestellen vermutlich einen eigenen Beitrag zur Gesamtstabilität der Proteinstruktur leistet. Die Entfaltung in Abhängigkeit verschiedener Thylakoidlipidumgebungen zeigte keinen signifikanten Einfluss von negativer Ladung (Phospholipid PG) oder möglichen Wasserstoffbrückenbindungen mit dem Galaktolipid DGDG auf die Stabilität der LHCII-Struktur. Dagegen erhöhte die Anwesenheit von MGDG deutlich die mechanische Stabilität des LHCII sowohl in Transmembrandomänen wie auch in einigen Schleifendomänen. Somit erfolgt diese Stabilisierung eher durch die Strukturkomplementarität zwischen kegelförmigem MGDG und uhrglasförmigem LHCII als durch ortsspezifische Wechselwirkungen.
Fluoreszenzbasierte Diffusionsmessungen (FRAP und FCS) in den SLBs sollten ermöglichen, die Art der LHCII-MGDG-Wechselwirkung zu verstehen. Eine „Raft“-Bildung mit MGDG-Lipiden (direkte Lipid- Protein-Assoziation) sollte zu einer Verlangsamung der LHCII-Diffusion führen. Die Komplexe konnten in SLBs zwar frei diffundieren, jedoch sind keine quantitativen Beurteilungen zur Mobilität des Proteins gelungen, da die Formierung von SLBs aus Galaktolipidvesikeln zu großen Lücken im Membransystem führte und damit die Streuung von Messwerten erhöhte. Eine zusätzliche Varianz der Messungen kam aufgrund von Ausstülpungen der flachen Membranoberfläche zu gestapelten Bereichen, jedoch nur in Anwesenheit von LHCII-Proteinen, zustande. Dieses Phänomen konnte genutzt werden, um mittels topographischer (AFM) und fluoreszenzmikroskopischer Aufnahmen Erkenntnisse zur Bedeutung der physikochemischen Eigenschaften von Thylakoidlipiden für die Granastruktur in Chloroplasten zu gewinnen. Bei der Membranadhäsion spielten offenbar nur Wechselwirkungen zwischen LHCII-Trimeren in gegenüberliegenden Membranschichten eine entscheidende Rolle (Velcro-Modell), die durch Salzbrücken zusätzlich verstärkt wurden. Zusätzlich begünstigte MGDG das Ausstülpen der Membran. Dies ist vermutlich damit zu erklären, dass die konvexe Geometrie von MGDG-Lipiden eine Krümmung der Lipiddoppelschicht erleichtert. Dank der Etablierung von AFM konnte mit dieser Arbeit der Weg für weiterführende Untersuchungen zur Faltung und Strukturstabilisierung des LHCII, z.B. in Abhängigkeit der Bindung bestimmter Pigmente, geebnet werden.