Analysen zur Funktionalität und Regulation einer neuen Isoform der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS2-2) - Untersuchung der Fähigkeit der NOS2-2 zur NO-Biosynthese und ihrer Regulation durch fünf spezifische Transkriptionsfaktoren

Abstract

Bioaktives Stickstoffmonoxid (NO) wird von Stickstoffmonoxid-Synthasen (NOS) gebildet und ist als Signalmolekül an sehr vielen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt. So ist bekannt, dass NO über viele verschiedene, teilweise epigenetische Mechanismen auch die Differenzierung bzw. die Fähigkeit der Selbsterneuerung und den Erhalt der Pluripotenz von Stammzellen beeinflussen kann. Das Enzym, dass in diesen Zusammenhängen typischerweise für die NO-Produktion verantwortlich ist, ist die vor allem aus dem Immunsystem bekannte induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase, genannt NOS2. Im Immunsystem herrscht die klassische Isoform der induzierbaren NO-Synthase vor, genannt NOS2-1-Isoform. Die bioinformatische Analyse von RNA-Seq-Datenbanken erbrachte nun Hinweise darauf, dass während der Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hESC) bzw. induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) zu verschiedenen spezifischen Gewebetypen (Kardiomyozyten, Chondrozyten, mesenchymalen Stromazellen, Neuronen und (Synzytio-)Trophoblastzellen) transient eine andere NOS2-Isoform exprimiert wird, die NOS2-2-Isoform. In dieser Arbeit wurde die NOS2-2 in Zellkultur exprimiert und mittels Griess-Assay auf die Fähigkeit zur NO-Produktion untersucht. Es konnte belegt werden, dass die NOS2-2 tatsächlich funktional im Sinne der Fähigkeit zur NO-Synthese ist und ihre transiente Expression mit einer transienten NO-Produktion einhergehen kann. Die bioinformatische Analyse ergab weiterhin, dass das Transkript der NOS2-2 sich von dem der NOS2-1 durch ein alternatives erstes Exon unterscheidet, das an die Stelle der ersten beiden Exons der NOS2-1 tritt. Dies deutet darauf hin, dass die Expression der NOS2-2 einer alternativen Regulation unterliegt und durch einen eigenen Promotor gesteuert werden könnte. Von der AG Kleinert wurden fünf Transkriptionsfaktoren identifiziert, die in der putativen NOS2-2-Promotorregion Bindungsstellen besitzen und zugleich in allen RNA-Seq-Datensätzen, in denen das NOS2-2-Transkript vorlag, übereinstimmend herauf- oder herunterreguliert waren (Transkriptionsfaktoren: Bmi1, LEF1, Meis1b, PLAG1 und Zpo1). In dieser Arbeit wurden die Transkriptionsfaktoren in DLD1-Zellkultur exprimiert und ihre Wirkung auf die NOS2-2-Expression mittels qRT-PCR analysiert. Es zeigte sich kein signifikanter Zusammenhang zwischen der Expression der einzelnen Transkriptionsfaktoren und dem NOS2-2 Expressionsniveau. Weitere Arbeiten müssen zeigen, ob die Expression der Transkriptionsfaktoren unter anderen Versuchsbedingungen die NOS2-2-Expression berührt.