Erstellung eines experimentellen Modells für radiochemoresistente Glioblastomzellen und Charakterisierung der Folgen klinisch relevanter Strahlen- und Temozolomid-Dosen auf Stammzelleneigenschaften, Proliferation und Chromatinstruktur in menschlichen Glioblastom-Stammzellen

Abstract

Glioblastom-Stammzellen (GSC) stehen im Zentrum der heterogenen Tumorarchitektur von Glioblastomen und sind von zentraler Bedeutung für die Tumorpathophysiologie durch ihre unlimitierte Selbsterneuerungsfähigkeit und multipotente Kapazität. Durch ihr breites Repertoire an inhärenten wie erworbenen Resistenzmechanismen wird die Therapieresistenz von Glioblastomen gegenüber dem etablierten Chemotherapeutikum Temozolomid (TMZ) und der Strahlentherapie wie ihre Rezidivbildung und ihr Progress in erster Linie durch GSC bestimmt. Das Ziel dieser Studie war die Rekapitulation der therapieinduzierten Veränderungen in GSC für die TMZ- und Strahlentherapie wie ihrer Kombination auf zellulärer, phänotypischer und epigenetischer Ebene. Hierdurch wird eine Identifizierung von Schlüsselprozessen ermöglicht, die an der Resistenz von Glioblastomen gegenüber der Radiochemotherapie beteiligt sind. Hierzu wurde ein experimentelles Modell für TMZ-resistente GSC etabliert, indem die GSC-Linie #1051 und ihr vorbestrahltes Äquivalent #1051_IR mit einer klinisch relevanten Dosis von 100 µM an TMZ in sechs Zyklen behandelt wurden und für eine Gesamtzeit von ca. 16 Wochen in Anwesenheit von TMZ gehalten wurden. Anschließend erfolgte die Charakterisierung der TMZ- und bestrahlungsinduzierten Veränderungen auf Ebene der Stammzellkapazität über das Extreme Limited Dilution Assay, während das Differenzierungs- und Proliferationspotenzial über die Immunfluoreszenz-gestützte Auswertung der GFAP- bzw. Ki67-Expression quantifiziert wurde. Ergänzend wurde die Verdopplungszeit der Zellen über Live-Mikroskopie bestimmt. Zur Untersuchung der epigenetischen und Chromatin-Veränderungen wurde die FAIRE-Methode in dieser Studie erstmalig für humane GSC etabliert. Als Referenzkontrolle wurden parallel dazu DMSO-behandelte Sublinien verwendet, da DMSO als Dissoziationsmedium für TMZ diente. Während der Behandlungszyklen mit TMZ zeichnete sich ein biphasischer Erholungstrend ab mit initial betonter Zytotoxizität und zunehmender Resistenz der GSC gegenüber TMZ. Vorbestrahlte GSC zeigten eine geringere Suszeptibilität gegenüber der TMZ-Zytotoxizität, die sich mit experimentellen Daten einer sequentiell beschränkten Wirkung der TMZ-Zytotoxizität deckt, die sich nur vor (und nicht nach) einer Bestrahlung entfaltet [474, 475]. Als Folge der mehrschrittigen Behandlung der GSC zeigte sich eine TMZ- wie Bestrahlungs-vermittelte Erhöhung der Stammzellfrequenz als Maß für eine verstärkte Selbsterneuerungskapazität, welche die vorhandene Evidenz über den Einfluss der Behandlungsmodalitäten auf die Stammzellkapazität rekapituliert [1, 34, 473, 484, 485, 489]. Dabei scheint dieser bekannte Behandlungseffekt nach aktuellem Wissensstand vorrangig durch eine Expansion der (therapieresistenten) GSC-Subpopulation und einer de novo-Bildung von (undifferenzierten) GSC durch die Induktion einer Konversion von differenzierten GB-Zellen begründet zu sein [484-486, 488]. Parallel zu diesem Therapieeffekt zeigte sich eine proliferationssteigernde Wirkung der TMZ- und Strahlenbehandlung. Ersteres bewirkte dabei eine drei- bis vierfache Erhöhung und Letzteres eine dreifache des Ki67-Index. Der Effekt beider Behandlungen wirkt damit initial depletierend für proliferierende Zellen und im Verlauf konträr hierzu verstärkend für die proliferative Aktivität, eine duale Wirkung, die in anderen Arbeiten nachvollzogen werden kann [1, 430, 477, 486, 507-510]. Erwähnenswert ist die deutliche Betonung der TMZ-vermittelten Proliferationssteigerung in vorbestrahlten GSC (im Vergleich zu unbestrahlten), die eine kooperative Proliferationssteigerung beider Therapiemodalitäten vermuten lässt. Interessanterweise konnten auch in GSC aus GB-Rezidiven nach Radiochemotherapie eine erhöhte Stammzell- und Proliferationskapazität festgestellt werden, als Hinweis für einen therapieinduzierten Wechsel von einem ruhenden zu einem proliferativen GSC-Phänotyp, der in dieser Arbeit in vitro rekapituliert werden konnte [500]. Auch hinsichtlich des Differenzierungsgrades ließ sich eine zur erhöhten Stammzellkapazität korrelierende Veränderung feststellen. Sowohl die TMZ- wie Strahlenbehandlung hatte eine verringerte GFAP-Expression und damit eine Reduktion des Differenzierungspotenzials zur Folge. Dies liefert neue Evidenz für den direkten inhibitiven Effekt beider Behandlungsmodalitäten auf das Differenzierungspotenzial von GSC und steht im Einklang mit der in der Literatur beschriebenen gegenläufigen Wechselwirkung zwischen der TMZ- und Radioresistenz und dem Differenzierungsgrad von GSC. Ihr nach nimmt die Therapieresistenz von GSC mit zunehmendem Differenzierungsgrad ab und bedeutet im Umkehrschluss einen abnehmenden Differenzierungsgrad bei zunehmender TMZ- und Strahlenresistenz [492-496, 504, 505]. Hinsichtlich der Proliferationsgeschwindigkeit zeigten die TMZ- und Strahlenbehandlung einen gegensätzlichen Effekt. Während die TMZ-selektierten GSC eine Verlängerung der Verdopplungszeit um ca. 6 bis 12 % zeigten, wiesen die vorbestrahlten GSC unabhängig von ihrer weiteren Behandlung eine verkürzte Verdopplungszeit (im Vergleich zu unbestrahlten GSC) auf. In Zusammenhang mit der vorhandenen Literatur lässt sich als Ursache der TMZ-vermittelten Verlängerung ein G2/M-Zellzyklusarrest vermuten, der bei TMZ-Resistenz eine rekonstruktive Rolle für Glioblastomzellen einnehmen kann [476]. Jedoch scheint die Beeinflussung des Zellzyklusarrests (und damit -dauer) durch TMZ einer heterogenen Antwort zu unterliegen und damit vielmehr einen linienspezifischen Effekt als einen universalen Teil der TMZ-Resistenz darzustellen [248]. Zuletzt erfolgte in dieser Arbeit erstmalig eine Optimierung und Etablierung der FAIRE-Methode für humane GSC-Linien zur Charakterisierung therapieinduzierter Chromatinveränderungen hinsichtlich transkriptionell aktiver Regionen. Hier zeigten sich divergierende Effekte der Behandlungsmodalitäten in regulatorischen Promotorregionen, wobei TMZ zu einer allgemeinen Kondensation und damit Gen-Silencing und Bestrahlung entgegengesetzt zu einer Chromatinöffnung ebendort und damit vermehrter Genexpression führte. Im spezifischen Kontext der Genregionen bewirkte TMZ eine Chromatinöffnung und damit Anreicherung von Promotoren, deren Gene mit der neuralen Differenzierung und Neurogenese verbunden sind, während die Bestrahlung hiervon abweichend zu einer Chromatinöffnung von Promotoren führte, deren Gene an dem Nukleinsäurestoffwechsel beteiligt sind. Dies bietet neue Einblicke in die TMZ- und bestrahlungsvermittelten epigenetischen Veränderungen in GSC als Abbild der epigenetischen Dysregulation in rekurrenten GB, die eine Schlüsselrolle in der Progression von Glioblastomen einnehmen und bisher kaum systematisch untersucht wurden. Interessanterweise konnten die TMZ-assoziierten epigenetischen Veränderungen in vorbestrahlten GSC nicht mehr festgestellt werden. Dies ist als einer von mehreren Hinweisen in dieser Arbeit eine neue deskriptive Evidenz für ein entweder allgemeines Konterkarieren von zytotoxischen Wirkungen oder spezifisches Konterkarieren der TMZ-Wirkung (auf GSC) durch eine vorherige Bestrahlung, eine Wechselwirkung, die bisher kaum erforscht ist [474, 475]. Die vorliegende Arbeit etabliert ein experimentelles Modell, das die Möglichkeit bietet, das Wirkungsspektrum und die Resistenzmechanismen von Behandlungsmodalitäten in zukünftigen Arbeiten systematisch in unterschiedlichen GSC zu charakterisieren sowie durch eine in vivo-Etablierung des Modells die gewonnenen Erkenntnisse mit der Tumorigenität der GSC zu korrelieren und den externen Einfluss des Tumormicroenvironments hierauf zu untersuchen.