Konstruktion eines HLA-unabhängigen "single-chain" T-Zellrezeptors (scTCR) gegen TRP2

Abstract

Im Blut der Melanompatientin Ma-Mel-86 mit HLA-negativer Erkrankung wurden in Vorarbeiten CD8+ zytotoxische T-Zellen entdeckt, die α/β-T-Zellrezeptoren (TCR) trugen und autologe Melanomzellen HLA-unabhängig lysierten. Ein Teil von ihnen erkannte TRP2 (engl. tyrosinase-related protein 2) als intaktes Molekül auf der Zellmembran. Die α- und die β-Kette des TCR eines der TRP2-reaktiven T-Zellklone wurden in einen bicistronischen retroviralen Vektor kloniert. Dieser dcTCR (engl. double-chain T cell receptor) reagierte mit humanem und murinem TRP2. Beim adoptiven Transfer von dcTCR-modifizierten T-Lymphozyten wurden in der Vergangenheit Fehlpaarungen mit endogenen TCR-Ketten beobachtet, die zu "off- target/off-tumor"-Toxizität und damit potentiell zu Autoimmunreaktionen führten. Um die Gefahr eines solchen "Mispairing“ weitestgehend zu reduzieren, wurde ein gegen TRP2 gerichteter scTCR (engl. single-chain T cell receptor) generiert. Er besteht aus den über einen 19 Aminosäuren langen, Glycin/Serin-reichen Linker (Li) verbundenen humanen variablen Domänen (hV) des originalen dcTCR und den kodonoptimierten murinen konstanten α- und β-Domänen (mC). In die mC-Regionen wurden Cystein-Moleküle für eine zweite stabilisierende Disulfidbrücke eingebaut. Das fertige scTCR-Konstrukt hVα-Li-hVβ-mCβ-F2A-mCα wurde in den retroviralen Vektor pMX-DEST kloniert. Jurkat 76-CD8hi-Zellen und PBMCs (engl. peripheral blood mononuclear cells) gesunder Spender wurden mit dem scTCR und dem dcTCR gegen TRP2 transduziert. Die Expression beider Rezeptoren wurde durchflusszytometrisch verifiziert. Erfolgreich transduzierte Blutlymphozyten wurden durch Stimulation mit TRP2+ Tumorzellen expandiert. Rezeptortragende CD8+ und CD4+ T-Zellen erkannten in IFNɣ-ELISPOT-Assays TRP2+ autologe und allogene Melanomzellen sowie humanes und murines TRP2 nach Transfektion in allogene und xenogene Zellen. Der scTCR erwies sich hinsichtlich seiner Funktionalität dem dcTCR sowohl in ELISPOT- als auch in Zytotoxizitäts-Assays als ebenbürtig. Im Weiteren soll der gegen TRP2 gerichtete scTCR in präklinischen Mausmodellen auf seine Funktionalität und Toxizität überprüft werden.