Aktivitätsabhängige Kontrolle der Apoptose in neonatalen kortikalen Neuronen und Etablierung eines Biosensors zur Echtzeitanalyse der Caspase-3-Aktivierung

Abstract

Die Apoptose spielt eine entscheidende Rolle während der normalen Entwicklung des zentralen Nervensystems. Elektrische Aktivität und die Versorgung mit trophischen Faktoren sind ausschlaggebend für das Überleben von Neuronen. Um zu untersuchen, welche zellulären Prozesse die aktivitätsabhängige Apoptose in organotypischen Schnittkulturen des neugeborenen Neokortex beeinflussen, wurde in der vorliegenden Arbeit immunzytochemisch das Auftreten aktivierter Caspase-3, nach pharmakologischer Beeinflussung von Ionenkanälen und membranständigen Rezeptoren analysiert. Die Unterdrückung neuronaler Aktivität durch den Natriumionenkanalblocker TTX führte zu einem signifikanten Verlust kortikaler Neuronen. Ein ähnlicher Anstieg der Zahl apoptotischer Neurone konnte durch Applikation von Antagonisten ionotroper Glutamatrezeptoren, GABAA-Rezeptoren oder neuronaler Gap Junctions induziert werden. Jedoch konnte bei einigen Antagonisten die apoptosefördernde Wirkung erst nach längerer Einwirkung beobachtet werden. Im Weiteren wurde eine Methode etabliert, mit deren Hilfe eine Echtzeitanalyse der Apoptose kortikaler Neurone unter dem Entzug trophischer Faktoren in Gegenwart unterschiedlicher extrazellulärer Kaliumkonzentrationen ermöglicht wurde. Dazu wurden dissoziierte kortikale Kulturen mit dem pCaspase3-sensor Vektor transfiziert. Das durch dieses Plasmid codierte fluoreszente Protein wird Caspase-3 abhängig gespalten. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Caspase3-sensor spezifisch für die Aktivierung der Caspase-3 ist, und dass die Überlebensfähigkeit der transfizierten Neurone durch das Transfektionsprotokoll nicht beeinflusst wird.

Apoptosis is an essential process during normal development of the brain. Electrical activity and supply with survival factors play a major role in regulating neuronal survival. I aimed at correlating neuronal activity and apoptosis in the developing murine neocortex. Therefore organotypic slice cultures of newborn mouse cerebral cortex were treated with antagonists of different ligand-gated receptors and voltage-dependent ion channels. Apoptosis was assessed using an antibody specific for the activated form of caspase-3. Blocking network activity by the sodium channel blocker TTX caused a significant loss of cortical neurons. Moreover application of antagonists of ionotropic glutamate receptors, GABAA receptors or neuronal gap junctions resulted in a similar increase in the number of apoptotic neurons. However some antagonists increased neuronal loss only after prolonged exposure. In a further approach an assay was established which involves the transfection of dissociated cultures of the newborn mouse neocortex with the pCaspase3-sensor vector encoding a protein sensitive to cleavage by caspase-3. With this assay the impact of different extracellular potassium concentrations on caspase-3 dependent cortical apoptosis following trophic deprivation should be elucidated. The method was found to be specific for caspase 3 activation and did not interfere with the viability of the transfected neurons.