Molekulare Untersuchungen onkologisch relevanter Biomarker als Baustein für die personalisierte Medizin

Abstract

Molekulare Untersuchungen onkologisch-relevanter Biomarker sind entscheidend für die personalisierte Medizin, da sie die Diagnose von Krebserkrankungen präzisieren und die Entwicklung zielgerichteter Therapien ermöglichen können. Durch die grundlagenwissenschaftliche Analyse von Tumor-assoziierten Strukturen können individuelle Tumoreigenschaften identifiziert und somit maßgeschneiderte Behandlungsstrategien entwickelt werden. Die Threonin Aspartase 1 (Taspase1) wurde in diesem Zusammenhang als onkologisch-relevante Protease mit Biomarker-Potential für verschiedene Tumorentitäten charakterisiert. Taspase1 spielt eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung von Mixed Lineage Leukemia (MLL)-Fusionsproteinen und demzufolge bei der Entstehung aggressiver Leukämien. Darüber hinaus wurde eine funktionelle Überexpression von Taspase1 bei einer Reihe von soliden Tumoren, wie auch den Kopf-Hals-Tumoren (head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC) gezeigt. Die Erforschung neuartiger Biomarker ist insbesondere auch für HNSCC notwendig, da HNSCC-Patienten durch Metastasierung und Rezidive eine äußerst schlechte Prognose aufweisen. Hier kann Taspase1 nicht nur als prognostischer Biomarker, sondern auch als mögliches therapeutisches Zielprotein dienen. Zur detaillierten Charakterisierung der onkologischen Aktivität von Taspase1 wurde im Rahmen dieser Arbeit ein besonderer Fokus auf Protein-Interaktionen und subzellulären Transportmechanismen gelegt, welche entscheidend an der Regulation ihrer proteolytischen Aktivität und somit ihrer onkogenen Wirkung beteiligt sind. Einer der wichtigsten und zugleich onkologisch-relevanten Interaktionspartner von Taspase1, welcher der Protease den Zugang zum Nukleus und insbesondere zum Nukleolus ermöglicht, ist Nucleophosmin1 (NPM1). Da eine Hemmung der spezifischen Taspase1-NPM1-Interaktion einen innovativen Ansatz zur Taspase1-Hemmung darstellt, wurde zunächst die Interaktionsdomäne beider Proteine identifiziert. Die hierfür generierte Deletions- und Lokalisationsmutanten von NPM1 wiesen auf eine funktionell bedeutsame Region im N-Terminus von NPM1 hin. Veränderungen im Bereich von ±100 Aminosäuren im N-Terminus beeinträchtigen die nukleoläre Lokalisation der NPM1-Mutanten. Die Aktivität von NPM1 wird zudem durch die Oligomerisationsdomäne gesteuert, wie Untersuchungen mit NPM1-knockdown-Zellen und Mutanten ohne Oligomerisationsdomäne belegen. Darüber hinaus wird die Interaktion von NPM1 mit Taspase1 hauptsächlich durch die N-terminale Oligomerisations-/Chaperondomäne gesteuert, wobei die C-terminale Region (aa187-260) ebenfalls eine wichtige Rolle spielt. Um die NPM1-Taspase1-Interaktion im Detail zu verstehen, wurden weitere Untersuchungen mit Hilfe von chimären Proteinen aus humaner und Drosophila Taspase1 (dTasp) durchgeführt. Im Gegensatz zur humanen Taspase1, zeigt die homologe Protease aus Drosophila keine Interaktion mit NPM1. Die proteolytisch aktive Taspase1 besteht aus zwei Untereinheiten, der α- und β- Untereinheit, welche in den hergestellten chimären Varianten aus unterschiedlichen Spezies stammen (α-hTasp/β-dTasp und α-dTasp/β-hTasp). Beide Taspase1-Chimären zeigten keine Interaktion mit endogenem NPM1. Lokalisationsstudien und Messung der proteolytischen Aktivität der chimären Proteasen verdeutlichten, dass die subzelluläre Taspase1-Lokalisation von der α-Untereinheit abhängt, während die proteolytische Aktivität von der β-Untereinheit gesteuert wird. Interessanterweise zeigen Zellen, welche NPM1-Mutanten in Kombination mit Taspase1 exprimieren, eine erhöhte Viabilität, was auf eine unterstützende Wirkung von Taspase1 auf NPM1 hinweist. Des Weiteren führte eine Taspase1-Überexpression zur gesteigerten Empfindlichkeit von HNSCC-Zellen gegenüber der chemotherapeutischen Behandlung mit Cisplatin. Eine kombinierte Chemo- und Strahlentherapie erwies sich als besonders effektiv, wobei höhere Cisplatin-Dosen einen synergistischen Effekt mit der Bestrahlung aufweisen. Neben der molekularen Untersuchung der Taspase1-NPM1-Interaktion, wurden zudem neuartige Möglichkeiten zur Etablierung von zirkulierenden Biomarkern für die Tumor-Diagnostik erforscht. Um einerseits die Behandlungsoption der Patienten zu optimieren und auf das Niveau einer personalisierten Therapie zu bringen, und andererseits eine frühere Diagnose der Erkrankung stellen zu können, wurden die im Rahmen von „liquid biopsy“ zirkulierende Tumorzellen im Blut von HNSCC-Patienten untersucht. Verschiedene Detektionssysteme und Kulturmethoden zur Isolierung und Identifikation dieser Zellen wurden optimiert. Kleine extrazelluläre Vesikel, sogenannte Exosomen, erwiesen sich als potenzielle Biomarker für die Frühdiagnostik. Experimente zur Isolierung und Untersuchung ihrer Interaktion mit anderen Zellen und Partikeln, sowie die zelluläre Aufnahme von Exosomen durch Makrophagen lieferten neue Einblicke in die Transportmechanismen innerhalb von Zellen. Diese Erkenntnisse legen nahe, dass Exosomen als diagnostische Biomarker, therapeutische Zielstrukturen oder Nanosysteme zur Medikamentenverabreichung genutzt werden könnten. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit wichtige Erkenntnisse gewonnen werden, welche neben ihrer grundlagenwissenschaftlichen Relevanz zudem das Potential haben, zukünftige Strategien der Krebs-Diagnostik und -Therapie zu beeinflussen.