Systematic interaction interface and variant characterization using protein interaction profiling

Abstract

Eine vielversprechende Strategie, das Edgotyping, nutzt Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke (PPI) zur systematischen Charakterisierung von Varianten und zur Aufdeckung von Krankheitsmechanismen, indem getestet wird, wie sich pathogene und nicht charakterisierte Mutationen auf Proteininteraktionen auswirken (Vidal et al. 2011; Sahni et al. 2013; Sahniet al. 2015; Fragoza et al. 2019; Cheng et al. 2023). Es wurden mehrere Versuche mit dem Edgotyping-Ansatz durchgeführt. So identifizierten Sahni et al. (2015) 197 Mutationen in 89 Wildtyp-Proteinen, wobei 26% einen vollständigen Verlust der Interaktion aufwiesen, 31% edgetisch waren und 43% unverändert blieben, unter Verwendung von Y2H. Unter Verwendung desselben Ansatzes bewerteten Fragoza et al. (2019) 1.676 Missense-Varianten in 4.109 Protein-Varianten-Interaktionen und identifizierten 298 störende Varianten, die 669 PPIs betreffen, und untersuchten deren funktionelle Auswirkungen. Dieser experimentelle Ansatz hat das Potenzial, uncharakterisierte Varianten zu adressieren, bleibt aber aufgrund der großen Anzahl dieser Varianten teuer und arbeitsintensiv.

In dieser Arbeit wird eine systematische Strategie zur Charakterisierung von Varianten an- hand von vorhergesagten und experimentell validierten DMI-Schnittstellen durch PPI-Profiling vorgeschlagen. Kapitel 2 befasst sich mit der Erstellung der ORFeome-Sammlung, der Bewertung der BRET-Empfindlichkeit und der Entwicklung einer Klonierungspipeline mit mittlerem Durch-satz sowie eines BRET-basierten Assays zur experimentellen Validierung von DMIs.

Artikel I zeigt die erfolgreiche Anwendung von Klonierung und ortsgerichteter Mutagenese mit geringem Durchsatz, gefolgt von BRET-Assays mit mittlerem Durchsatz, um DMI-vermittelte PPIs, die am Spleißen beteiligt sind, experimentell zu validieren. Artikel II stellt eine optimierte plattenbasierte Klonierungspipeline und einen BRET-Assay zur Validierung neuartiger vorhergesagter Schnittstellen und zur Analyse von Mutantenpositionen und deren Potenzial zur Unterbrechung dieser Schnittstellen vor, basierend auf vorhergesagten Schnittstellenstrukturen aus AF-MM. Somit zeigen sowohl Artikel I als auch Artikel II die Etablierung eines systematischen Ansatzes für die experimentelle Validierung mutmaßlicher DMIs. Kapitel 3 beschreibt die Entwicklung des DMI-Prädiktors und seine Anwendung bei der Vorhersage und Kartierung dieser DMIs anhand von HuRI-PPI-Daten, gefolgt von der Integration von ClinVar-Mutationsdaten mit vorhergesagten DMIs. Außerdem wird die Auswahl der PPIs beschrieben, die mit DMIs kartiert wurden und für eine experimentelle Validierung geeignet sind. Im Ergebnis konnten wir 46 von 96 PPIs mit dem BRET-Assay bestätigen. Von diesen haben wir die vorhergesagten DMIs von 22 Interaktionen weiter ausgewertet und 6 Kandidatenproteine (CTBP1, WWOX, PPP3CA, REPS1, SPOP und IQCB1) identifiziert. Dies zeigt, dass die Integration von DMI-Informationen mit der Erstellung von Proteininteraktionsprofilen dazu beitragen kann, Varianten zu charakterisieren, unser Verständnis der Auswirkungen von Varianten auf PPIs zu verbessern und tiefere Einblicke in die Mechanismen dieser Varianten und ihre potenziellen Beiträge zu Krankheiten zu liefern.