Novel fibroblast activation protein inhibitor-based radiopharmaceuticals for improved theranostic application in various cancer types
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Abstract
Tumore bestehen nicht nur aus Krebszellen, sondern sind von einer Tumormikroumgebung umgeben, die sich aus verschiedenen Komponenten wie aktivierten Fibroblasten, Immunzellen, vaskulären Zellen, extrazellulärer Matrix etc. zusammensetzt. Die sogenannten Krebs-assoziierten Fibroblasten machen in vielen epithelialen Tumoren einen großen Anteil an der Gesamttumormasse aus. Das Fibroblasten-Aktivierungs-Protein alpha (FAP) ist eine besonders interessante onkologische Zielstruktur, da es von aktivierten Fibroblasten stark exprimiert wird und in mehr als 90% epithelialer Tumore vorkommt. Diese Adressierung ist sehr interessant, da dieser Pan-Tumor-Ansatz die Anwendung in sehr vielen verschiedenen Krebsarten ermöglicht.
FAP ist eine Transmembran-Serinprotease und ist neben der starken Expression in der Tumormikroumgebung auch in Prozessen wie Wundheilung, (chronischen) Entzündungen, Fibrosen (Leber, Bauchspeicheldrüse, Lunge) oder rheumatoider Arthritis beteiligt. Im Gegensatz dazu ist in gesundem Gewebe nicht oder nur sehr schwach exprimiert. Diese selektive Expression ist eine essentielle Bedingung für die Eignung als onkologisches Target. Es ermöglicht die selektive Anreicherung eines diagnostischen oder therapeutischen Medikaments im Tumor bzw. der Tumormikroumgebung, wenn dieses einen FAP-selektiven Targetvektor beinhaltet.
Ein hochaffiner und selektiver FAP-Inhibitor (FAPi) UAMC-1110 wurde 2018 als Targetvektor für die ersten niedermolekularen Radiopharmaka verwendet, die verschiedenste epitheliale Tumore mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) erfolgreich visualisieren konnten. Innerhalb weniger Jahre konnte gezeigt werden, dass die molekulare Bildgebung mittels PET dieser hauptsächlich 68Ga-markierten Radiopharmaka sehr vielversprechende diagnostische Ergebnisse erbringt. Die Translation hin zu wirksamen therapeutischen Radiopharmaka für die Endoradiotherapie (ERT) ist jedoch weiterhin herausfordernd. Problematisch ist hier vor allem die zu geringe Verweildauer im Tumor. Fortschritte bzgl. der im Tumor deponierten Strahlendosis konnten mit dem FAPi Homodimer DOTAGA.(SA.FAPi)2 erreicht werden, welches zwei FAPi Targetvektoren und einen bifunktionellen Chelator für Radiomarkierung besitzt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Chelator-basierte FAPi-Radiopharmaka entwickelt, hergestellt und untersucht, die eine verbesserte theranostische, d.h. diagnostische und therapeutische, Anwendung in verschiedenen epithelialen Tumoren ermöglichen. Nach der organischen Synthese der Verbindungen wurden die Radiomarkierungseigenschaften inklusive Komplexstabilität und Lipophilie der hergestellten Radiopharmaka untersucht. Weiterhin wurden Bindungs-affinitätsstudien bzgl. FAP und den konkurrierenden Proteasen PREP, DPP4, DPP8 und DPP9 durchgeführt, um die Affinität und Selektivität in vitro zu bestimmen. Einige der Verbindungen wurden darüber hinaus in ersten klinischen Studien eingesetzt.
Besonderer Fokus lag auf verbesserten therapeutischen Radiopharmaka, weshalb in Projekt 1 und 2 dieser Arbeit neue FAPi-Homodimere hergestellt wurden. Dafür wurde ein neues molekulares Design konzipiert, bei dem die beiden FAPi-Targetvektoren und der Chelator über eine zentrale Linker-Einheit miteinander verknüpft werden.
Die Verbindungen DOTAGA.Glu.(FAPi)2 und DO3A.Glu.(FAPi)2 wurden in Projekt 1 synthetisiert. Anschließend wurde die Radiomarkierung mit Gallium-68, Lutetium-177, Actinium-225 und Yttium-90 untersucht. In allen Fällen konnte eine (nahezu) quantitative radiochemische Umsetzung (RCU) erzielt und Radiopharmaka in hoher radiochemischer Reinheit (RCP > 98%) hergestellt werden. Alle Radiopharmaka zeigten hohe Komplexstabilitäten über zwei Halbwerts-zeiten in verschiedenen Medien und waren hydrophil. Die in vitro-Studien ergaben eine sehr hohe FAP-Affinität mit subnanomolaren IC50-Werten und hohe Selektivität gegenüber den Konkurrenzproteasen.
Die vielversprechenden Ergebnisse wurden in einer ersten klinischen Anwendung bestätigt. [177Lu]Lu-DOTAGA.Glu.(FAPi)2 zeigte eine ähnlich lange Tumorverweilzeit in einem Patient mit Schilddrüsenkrebs im Vergleich zur vorherigen Behandlung mit [177Lu]Lu-DOTAGA.(SA.FAPi)2. Darüber hinaus wurden verbesserte pharmakologische Eigenschaften, eine schnellere Ausschei-dungskinetik und geringere Aufnahme in Leber und Darm beobachtet, welches die Strahlendosis für diese Organe reduziert.
Über 70 stark vorbehandelte Patienten wurden und werden mit [177Lu]Lu-DOTAGA.Glu.(FAPi)2 behandelt, wovon einige vorher mit [177Lu]Lu-DOTAGA.(SA.FAPi)2 therapiert wurden. Dies sind hauptsächlich Schilddrüsen- und Brustkrebs-Patienten, aber auch ein Glioblastoma-Patient, der einen deutlichen Rückgang des Primärtumors nach Radioligandentherapie mit [177Lu]Lu-DOTAGA.Glu.(FAPi)2 verzeichnete. Die vorläufigen Ergebnisse an 19 Brustkrebspatienten zeigten eine positive Ansprache mit verringerten Schmerzen in 95% und eine partielle Remission des Tumorvolumens in mindestens vier der neun nach 14 Monaten noch lebenden Patienten. Bei über 50% der 39 Schilddrüsenkrebspatienten konnte ein Rückgang des Tumormarkers Thyreoglobulin beobachtet werden.
In Projekt 2 wurden fünf weitere FAPi-Homodimere synthetisiert, bei denen im Vergleich zu [177Lu]Lu-DOTAGA.Glu.(FAPi)2 die Linker-Einheit variiert oder zusätzliche Spacer-Einheiten eingeführt wurden. In den Radiomarkierungen mit Gallium-68 und Lutetium-177 wurden bis auf die 68Ga-Markierung eines Derivates quantitative RCU und hohe RCP über 98% erreicht. [68Ga]Ga-DOTAGA.PEG2.Glu.(FAPi)2 zeigte verbesserte Markierungseigenschaften und ließ sich in mehreren Puffersystemen gleich gut markieren. Alle Verbindungen waren ähnlich hydrophil wie [68Ga]Ga- bzw. [177Lu]Lu-DOTAGA.Glu.(FAPi)2. Bis auf einen Komplex, wiesen alle hergestellten Radiopharmaka eine Komplexstabilität über 90% über zwei Halbwertszeiten auf. Die in vitro-Bindungsstudien ergaben ähnliche Ergebnisse wie für DOTAGA.Glu.(FAPi)2. Die beiden
Verbindungen DOTAGA.NPyr.(FAPi)2 und DOTAGA.PEG2.Glu.(FAPi)2 zeigten leicht verbesserte DPP4-Selektivität, DO3A.NPyr.(FAPi)2 verbesserte DPP4- und PREP-Selektivität.
Die vielversprechenden Eigenschaften machen die neuen FAPi-Homodimere interessant für folgende in vivo-Applikationen.
Das dritte Projekt hatte das Ziel neue FAPi-Radiopharmaka herzustellen, welche die Diagnostik mittels 68Ga-PET vor und nach einer Therapie mit [177Lu]Lu-DOTAGA.Glu.(FAPi)2 verbessern sollen. Es wurden FAPi-Monomere hergestellt, die sich strukturell nur dadurch unterscheiden, dass ein FAPi-Targetvektor durch ein „inerte“ Gruppe (Pyrrolidin, Pyr) substituiert wurde.
Nach der organisch-chemischen Synthese der Verbindungen DATA5m-, DO3A- und DOTAGA.Glu(Pyr).FAPi wurden diese mit Gallium-68 markiert. Quantitative RCU und hohe RCP > 98% wurde für alle Verbindungen in jeweils drei verschiedenen Puffersystemen erreicht. [68Ga]Ga-DO3A.Glu(Pyr).FAPi und [68Ga]Ga-DOTAGA.Glu(Pyr).FAPi waren ähnlich hydrophil wie [68Ga]Ga-DOTAGA.Glu.(FAPi)2 und beiden neuen Radiotracer waren nach zwei Stunden in verschiedenen Medien zu ca. 95% stabil. In vitro-Studien der Präkursoren und natGa-Komplexe zeigten verbesserte Affinität und Selektivität gegenüber dem bisher in der Therapiekontrolle verwendeten [68Ga]Ga-DOTA.SA.FAPi, besonders für das DO3A- und DOTAGA-Derivat.
Beide Verbindungen zeigten in einer ersten humanen Anwendung hohe Tumoranreicherung. Es wurde physiologischer Uptake im Pankreas vergleichbar zu [68Ga]Ga-DOTA.SA.FAPi beobachtet. Ansonsten war die Akkumulation in gesunden Organen gering, außer dass [68Ga]Ga-DO3A.Glu(Pyr).FAPi etwas Leber-Uptake zeigte und [68Ga]Ga-DOTAGA.Glu(Pyr).FAPi eine Stunde nach Injektion noch etwas Aktivität im Blut zirkulierte. Insgesamt sind die Ergebnisse vielversprechend. Ob eine oder mehrere der neuen Verbindungen Vorteile gegenüber [68Ga]Ga-DOTA.SA.FAPi bei der PET vor und nach 177Lu-FAPi-Dimer-Therapie bringt, muss in weiteren (prä)klinischen Studien systematisch untersucht werden.
Im Rahmen des vierten Projektes wurden 99mTc-Radiopharmaka für die Anwendung in der Einzelphotonen-Emissionscomputertomographie (SPECT) entwickelt. Dafür wurden die beiden Chelatoren N4 und MAG3 wurden für die Komplexierung von 99mTc(V) gewählt, sowie die Quadratsäure (SA) als Linker analog zu DOTA.SA.FAPi. Die beiden Markierungsvorläufer NA.SA.FAPi und S-Bz-MAG3.SA.FAPi wurden in einer sieben- bzw. neunstufigen Synthese erfolgreich hergestellt und in vitro untersucht. Es konnten hohe Affinitäten, ähnliche PREP- und verbesserte DPP4- Selektivitäten im Vergleich zu DOTA.SA.FAPi gemessen werden. Außerdem wurde die Radiomarkierung von [99mTc]Tc-MAG3.SA.FAPi bei Raumtemperatur und 90 °C untersucht und in beiden Fällen konnte quantitative RCU erreicht werden. Es wurde eine hohe Stabilität (≥ 90%) nach vier Stunden Inkubation in diversen Medien beobachtet. Des Weiteren wurde eine erste Synthese-Automation durchgeführt.
[99mTc]Tc-MAG3.SA.FAPi scheint ein geeigneter Kandidat für in vivo-SPECT-Untersuchungen.