Enzyme tRNA interaction and (t)RNA conformation probed via environmentally sensitive cyanine dyes

Abstract

Nukleosidmodifikationen beeinflussen Dynamik und Konformation von RNArnund sind epigenetisch wirksam. Wenig verstanden sind konformationelle Dynamik und enzymatische Erkennung von tRNA, sowie der Einfluss des mutmaßlichen kovalenten Inhibitors 5-Fluorouridine (5FU) auf Y Synthasen, die Pseudouridin (Y) erzeugen. Frühere Arbeiten nutzten mit den Fluorophoren Cy3 und Cy5rnmarkierte tRNA, um diese Fragen zu adressieren.rnDie vorliegende Arbeit weitet Cy3-Cy5-Markierung auf Hefe tRNArnPhernaus undrnnutzt Thermophorese und fortschrittliche Fluoreszenzspektroskopie. In der Thermophorese zeigte sich eine hohe Toleranz gegenüber Fluoreszenzmarkierung beirngleichzeitiger Erhöhung der Cy5 Fluoreszenz durch Enzymbindung. Zudem konnte die Konformation verschiedener Mutanten human mitochondrialer tRNArnLysrnund die Bindung von SAM durch SAM-I Riboswitch RNA untersucht werden.rnUm etwaige Unterschiede in der Interaktion von Y55 Synthase TruB mit Cy5-gelabelter U55- bzw. 5FU55-tRNA aufzudecken, wurde eine Kombination ausrnThermophorese, zeit- und polarisationsaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie undrnâ gel shiftâ Experimenten genutzt. Alle Ergebnisse zeigten übereinstimmend einernreversible Bindung ähnlicher Affinität für beide tRNAs und widersprechen somit einer kovalenten Inhibition durch 5FU. Folgerichtig wurde der SDS-stabilernKomplex von TruB mit 5FU-tRNA neu evaluiert, da er bisher als kovalent interpretiert wurde. Es erfolgte eine schnelle Komplexbildung in hoher Ausbeute auchrnfür schlechte Substrate, außerdem ließ sich die Komplexausbeute nicht durch andere Reaktionsbedingungen beeinflussen. Somit kann der SDS stabile Komplexrnnur den ersten, nicht-kovalenten Kontakt von Enzym und 5FU55-tRNA darstellen und repräsentiert kein kovalentes Addukt späterer Katalyse.

Nucleoside modifications influence RNA dynamics and function and act in epigenetics. However, conformational dynamics and modification enzyme recognitionrnof the most densely modified RNA tRNA are still ill understood. Furthermore,rnthe influence of the presumed covalent mechanistic inhibitor 5-fluorouridine (5FU)rnon Y synthase enzymes, which generate pseudouridine (Y) is as enigmatic asrnever.rnThis uses work uses tRNAs labeled with the cyanine fluorophores Cy3 and Cy5rnand applies thermophoresis and advanced fluorescence spectroscopy. A remarkable tolerance of dye-labeling and for the detected dye Cy5 an increase of fluorescence lifetime upon enzyme binding were revealed in thermophoresis binding assays. Moreover, thermophoresis assays could detect conformational differences in mutants of human mitochondrial tRNArnLysrnand SAM biding by SAM-Irnriboswitch RNA.rnTo elucidate the action of 5FU-RNA on Y55 synthase TruB, thermophoresis andrntime-resolved fluorescence binding assays were applied using Cy5-labeled tRNA.rnIn agreement with gel shift experiments all results reveal reversible binding withrna similar affinity of TruB for U55- and 5FU55-tRNA over the time span of several hours. A reevaluation of the SDS-stable 5FU-RNA TruB complex, previouslyrninterpreted as covalent adduct resulting from catalytic suicide action of 5FU, revealed a fast complex formation in high yield even for the poor substrate U33rntRNA. More stringent incubation conditions did not change complex yield. Thusrnthe SDS stable band represents the initial contact of RNA and enzyme and not arnsuicide adduct resulting from catalysis.