The role of FUBP1 in splicing, disease and evolution

Abstract

Splicing is the process of intron excision and exon re-ligation, and it is a crucial step of gene regulation. Mechanistically, splicing is well studied. However, splicing is a highly regulated process and there are multitudes of cis-regulatory and trans-acting elements that control splicing. This socalled “splicing code” is less understood, and in this study, we employed an array of high-throughput sequencing methods, coupled to structural biology, mathematical modeling and molecular biological experiments, to examine the role of the Far-Upstream Binding Protein FUBP1 in splicing and further, the regulation of CD19 mRNA splicing. Previous studies showed that the transcription factor FUBP1 also regulates certain splicing events. Additionally, demonstrated that FUBP1 stabilizes U2AF2, a core splicing component, to the py-tract. So far, however, the transcriptome-wide role of FUBP1 in splicing remains elusive. We showed that FUBP1 binds to a hitherto unknown U-rich sequence upstream of the branch point. It binds more than 80% of all pre-mRNA, rendering it a core splicing factor. Using NMR-based technologies and reporter assays, we showed that FUBP1 interacts with proteins of both the 3’ss and the 5’ss. We found that the N-terminal N-box of FUBP1 interacts with the RRM2 domain of U2AF2. In addition, an animal-specific C-terminal A/B-box of FUBP1 interacts with proline-rich stretches of SF1. RNA-seq of two FUBP1 mutant cell lines generated by CRISPR/Cas9 revealed that exons flanked by long introns are skipped when FUBP1 is lost. Analyzing RNA-seq of low-grade glioma patients with FUBP1 deficiencies yielded comparable results, indicating that FUBP1 facilitates splicing of long introns. We hypothesize that FUBP1 evolved to regulate splicing of long introns in higher eukaryotes by interacting with both the 3’ss and the 5’ss, connecting the splice sites. In a second study, we dissected the elements that are important for splicing of CD19 mRNA. B cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) patients can be treated with the cell-based immunotherapy CART-19, which specifically targets CD19-expressing cells. However, they often experience relapse due to CD19 epitope loss. Using a high-throughput mutagenesis approach, we detected over 200 mutations that lead to approx. 100 cryptic isoforms that can contribute to epitope loss. By cloning a selection of the mutations into a CD19 minigene and performing RT-PCR, we could confirm these results. In addition, shRNA-induced KD of splicing factors revealed that trans-acting factors like SF3B4 and PTBP1 are essential for correct CD19 splicing. With this study, we offer a comprehensive overview of the CD19 splicing code. Taken together, this PhD thesis highlights the interdependency between cis- and trans-acting splicing components. It underlines the importance of splicing – and the knowledge thereof – in the context of health and disease.

Spleißen ist der Prozess der Entfernung von Introns und dem Verbinden von Exons. Es ist ein zentraler Teil der Genregulation. Mechanistisch ist Spleißen gut untersucht. Aber Spleißen ist ein stark regulierter Prozess mit einer Vielzahl von cis-regulierenden und trans-agierenden Elementen, die das Spleißen beeinflussen. Dieser sogenannte „Spleißschlüssel“ ist weniger gut verstanden. In dieser Studie verwendeten wir mehrere Hochdurchsatzsequenziermethoden zusammen mit Strukturbiologie, mathematischem Modellieren und Molekularbiologie, um den Einfluss von FUBP1 auf das Spleißen zu erforschen und um die Spleißregulation von CD19 mRNA zu verstehen. Studien fanden heraus, dass der Transkriptionsfaktor FUBP1 auch bestimmte Spleißereignisse reguliert. Unsere Arbeitsgruppe zeigte, dass FUBP1 U2AF2, eine zentrale Spleißkomponente, am Py-Trakt stabilisiert. Die transkriptomweite Rolle von FUBP1 während des Spleißens bleibt jedoch unerforscht. Wir zeigten hier, dass FUBP1 an eine bisher unbekannte, U-reiche Sequenz oberhalb des Verzweigungspunkt bindet. Es bindet mehr als 80% aller prä-mRNA, was es zu einem zentralen Spleißfaktor macht. Mit NMR-basierten Technologien und Reporterassays konnten wir zeigen, dass FUBP1 sowohl mit Proteinen der 3‘ als auch der 5‘ Spleißstelle interagiert. Wir stellten fest, dass die N-terminale N-box von FUBP1 mit der RRM2-Domäne von U2AF2 interagiert. RNASequenzierung von zwei FUBP1-Mutatenzelllinien, die mit CRISPR/Cas9 generiert wurden, ergab, dass Exons, die von langen Introns umgeben sind, in der Abwesenheit von FUBP1 übersprungen werden. Analysen von RNA-Sequenzierungen von Patienten mit niedriggradigen Gliomen und FUBP1-Defizienz ergab vergleichbare Ergebnisse, was darauf hinweist, dass FUBP1 das Spleißen langer Introns ermöglicht. Wir vermuten, dass FUBP1 sich evolutionär entwickelte, um das Spleißen langer Introns in höheren Eukaryoten zu regulieren, indem es die 3‘ und 5‘ Spleißstellen verbindet. In einer zweiten Studie analysierten wir Elemente, die für das Spleißen der CD19 mRNA relevant sind. Patienten mit akuter lymphoblastischer B-Zellleukämie (B-ALL) können mit der zellbasierten CART-19 Immuntherapie behandelt werden, die spezifisch CD19-exprimierende Zellen eliminiert. Dennoch können Patienten einen Rückfall durch den Verlust des CD19-Epitops erleiden. Mithilfe einer Hochdurchsatzmutagenese konnten wir 200 Mutationen detektieren, die zu ca. 100 kryptischen Isoformen und damit zu Epitopverlust führen können. Wir klonierten eine Auswahl dieser Mutationen in ein CD19 Minigen und führten eine RT-PCR durch, die diese Ergebnisse bestätigte. Außerdem konnte eine shRNA-induzierte Reduktion verschiedener Spleißfaktoren zeigen, dass trans-agierende Faktoren wie SF3B4 und PTBP1 für das Spleißen von CD19 essenziell sind. Mit dieser Studie bieten wir einen umfassenden Überblick über den CD19 Spleißschlüssel. Zusammengefasst beleuchtet diese Doktorarbeit die Abhängigkeit von cis- und trans-agierenden Spleißkomponenten. Es unterstreicht die Wichtigkeit von Spleißen – und das Wissen darüber – in Gesundheit und Krankheit.