New enhancement strategies for plasmon-enhanced fluorescence biosensors

Abstract

This thesis investigates metallic nanostructures exhibiting surface plasmon resonance for the amplification of fluorescence signal in sandwich immunoassays. In this approach, an analyte is captured by an antibody immobilized on a plasmonic structure and detected by a subsequently bound fluorophore labeled detection antibody. The highly confined field of surface plasmons originates from collective charge oscillations which are associated with high electromagnetic field enhancements at the metal surface and allow for greatly increased fluorescence signal from the attached fluorophores. This feature allows for improving the signal-to-noise ratio in fluorescence measurements and thus advancing the sensitivity of the sensor platform. In particular, the thesis presents two plasmonic nanostructures that amplify fluorescence signal in devices that rely on epifluorescence geometry, in which the fluorophore absorbs and emits light from the same direction perpendicular to the substrate surface.rnThe first is a crossed relief gold grating that supports propagating surface plasmon polaritons (SPPs) and second, gold nanoparticles embedded in refractive index symmetric environment exhibiting collective localized surface plasmons (cLSPs). Finite-difference time-domain simulations are performed in order to design structures for the optimum amplification of established Cy5 and Alexa Fluor 647 fluorophore labels with the absorption and emission wavelengths in the red region of spectrum. The design takes into account combined effect of surface plasmon-enhanced excitation rate, directional surface plasmon-driven emission and modified quantum yield for characteristic distances in immunoassays. Homebuilt optical instruments are developed for the experimental observation of the surface plasmon mode spectrum, measurements of the angular distribution of surface plasmon-coupled fluorescence light and a setup mimicking commercial fluorescence reading systems in epifluorescence geometry.rnCrossed relief grating structures are prepared by interference lithography and multiple copies are made by UV nanoimprint lithography. The fabricated crossed diffraction gratings were utilized for sandwich immunoassay-based detection of the clinically relevant inflammation marker interleukin 6 (IL-6). The enhancement factor of the crossed grating reached EF=100 when compared to a flat gold substrate. This result is comparable to the highest reported enhancements to date, for fluorophores with relatively high intrinsic quantum yield. The measured enhancement factor excellently agrees with the predictions of the simulations and the mechanisms of the enhancement are explained in detail. Main contributions were the high electric field intensity enhancement (30-fold increase) and the directional fluorescence emission at (4-fold increase) compared to a flat gold substrate.rnCollective localized surface plasmons (cLSPs) hold potential for even stronger fluorescence enhancement of EF=1000, due to higher electric field intensity confinement. cLSPs are established by diffractive coupling of the localized surface plasmon resonance (LSPR) of metallic nanoparticles and result in a narrow resonance. Due to the narrow resonance, it is hard to overlap the cLSPs mode with the absorption and emission bands of the used fluorophore, simultaneously. Therefore, a novel two resonance structure that supports SPP and cLSP modes was proposed. It consists of a 2D array of cylindrical gold nanoparticles above a low refractive index polymer and a silver film. A structure that supports the proposed SPP and cLSP modes was prepared by employing laser interference lithography and the measured mode spectrum was compared to simulation results.rn

Diese Dissertation untersucht die Möglichkeiten der Fluoreszenzverstärkung in Sandwich-Immunoassays mittels Oberflächenplasmonen. Bei dieser Methode wird ein Analyt mit einem Antikörper auf einer metallischen Nanostruktur gebunden und mit einem weiteren Antikörper mit Fluoreszenzmarker detektiert. Die hochkonzentrierten elektromagnetischen Felder der Oberflächenplasmonen auf der Oberfläche von metallischen Nanostrukturen erlauben eine signifikante Verstärkung des Fluoreszenzsignals des gebundenen Fluoreszenzmarkers. Diese Eigenschaft erlaubt es, das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern und somit die Sensitivität des Sensors zu erhöhen. rnInsbesondere werden zwei plasmonische Strukturen untersucht, bei denen das Fluoreszenzlicht senkrecht zur Oberfläche detektiert wird (Epifluoreszenz-Anordnung). Die erste Struktur ist ein kontinuierliches Gold-Nanogitter, welches die Anregung von propagierenden Oberflächenplasmonen erlaubt. Die zweite Struktur besteht aus Gold-Nanopartikeln in einer Brechungsindex-symmetrischen Anordnung (kollektive lokalisierte Oberflächenplasmonen). rnUm effiziente Strukturen für die Anwendung mit den Fluoreszenzmarkern Cy5 und AlexaFluor647 zu entwerfen wird die Finite-Difference Time-Domain Simulationsmethode verwendet. Diese Simulationen erlauben die Berechnung der Anregungsrate, der gerichteten Emission und der Änderung der Quanteneffizienz der verwendeten Fluoreszenzmarker. Überdies wurden optische Messsysteme zur Messung der winkelaufgelösten Fluoreszenzemission, des Modenspektrums und ein Epifluoreszenzmessgerät aufgebaut.rnDie Gold-Nanogitter wurden mittels Interferenzlithographie hergestellt und mit UV-Nanoimprint-Lithographie repliziert. Die hergestellten Nanostrukturen werden zur Detektion von Interleukin 6 mittels Immunoassay verwendet. Das Fluoreszenzsignal konnte um einen Faktor EF≈100, im Vergleich zu einer flachen Goldoberfläche, gesteigert werden und ist somit vergleichbar mit den höchsten zurzeit erreichten Verstärkungsfaktoren für Fluorophore mit hoher Quanteneffizienz. Der gemessene Verstärkungsfaktor stimmt hervorragend mit den Vorhersagen der Simulationen überein und die Effekte der Verstärkung werden im Detail geklärt. Die Hauptursachen sind die verstärkte elektrische Feldintensität (30-fache Verstärkung), sowie die gerichtete Emission des Fluoreszenzlichtes (4-fache Verstärkung). rnKollektive lokalisierte Oberflächenplasmonen haben durch die stärkere Feldkonzentration ein noch größeres Verstärkungspotential (EF≈1000). Kollektive Oberflächenplasmonen beruhen auf Beugungseffekten zwischen den Nanopartikeln und resultieren in ausgeprägten Resonanzen. Die vorgeschlagene Struktur besteht aus Gold-Nanozylindern auf einem Polymer mit geringem Brechungsindex und einem Silberfilm. Die Struktur wurde mittels Interferenzlithographie hergestellt und das gemessene Modenspektrum mit Simulationen verglichen.rn