Thermoresponsive behavior and in vitro investigations of random copolymers of ethylene oxide and glycidyl methyl ether (rPEGs)

Abstract

Polyethers are crucial materials in modern medicine, with polyethylene glycol (PEG) being the most prominent member of this class with a global production of 2.5 million metric tons in 2022. Derived from the polymerization of ethylene oxide (EO) via anionic ring-opening polymerization (AROP), PEG presents exceptional characteristics: it is water soluble, biocompatible and can be excreted through the human renal system up to a molecular weight of 30 kDa. PEGylation – the process of functionalizing active pharmaceutical ingredients (APIs) with PEG – has revolutionized drug delivery research in medical science since its discovery in the 1970s. By enveloping APIs with a corona of PEG molecules, the immune reaction to these compounds is significantly reduced, thanks to the inhibition of opsonin adsorption. This phenomenon, known as the "stealth effect", prolongs the circulation time of PEGylated compounds in the bloodstream significantly compared to their non-modified counterparts. In March 1990 the first PEGylated protein (Adagen® by Enzon Pharmaceuticals) was approved by the food and drug administration (FDA) for application and since then dozens more have entered the market. As of 2023, 38 PEGylated drugs have earned approval by the FDA. However, the discovery of the stealth effect was soon met with the detection of anti-PEG antibodies (APAs). These antibodies can induce chronic adverse reactions to PEG, ranging from accelerated blood clearance (ABC), which counteracts the stealth effect, to hypersensitive reactions similar to anaphylactic symptoms. Recent studies suggest that APAs are present in 83 % of the German general population, likely due to extensive exposure to PEG in everyday household products. This underscores the need for alternatives to PEG that can mitigate immune responses while maintaining its beneficial properties. To counteract the increasing problem of immunogenic reactions to PEG, extensive research is performed to develop alternatives for PEGylation. We have recently developed a synthesis for random copolymers of EO and glycidyl methyl ether (GME), which have the potential to be a viable alternative for PEG in case of severe immunogenic reactions. These “rPEGs” are structurally isomeric to PEG but possess randomly distributed side chains at the polymer backbone to prevent antibody binding. Previously, copolymers with GME could not be synthesized under GMPcertified conditions, excluding them from biomedical applications. However, we have successfully synthesized random copolymers of EO and GME under the same GMP compliant AROP conditions that are used for the synthesis of PEG, granting the possibility of medical usage. This thesis covers the synthesis of rPEGs via AROP, functionalization of the copolymers through post-polymerization reactions, investigations of physicochemical properties as well as behavior towards antibodies and proteins under in vitro conditions. A theoretical framework for the synthesis, properties and application of polyethers with a focus on PEG is provided in Chapter 1. Additionally, general concepts of PEGylation and the phase behavior of polyethers in aqueous solutions are discussed. Chapter 2 covers the synthesis of the monomer GME and its copolymerization procedure with EO. Several copolymers with constant chain length and varying molar amount of GME were synthesized and characterized via NMR spectroscopy, MALDI TOF mass spectrometry and GPC. The results show a reproducible synthesis for rPEGs of a molar GME content up to 80 mol %. A homopolymer of GME with a chain length of Dp = 103 could be synthesized and used for further measurements, but GME homopolymerization still provides limited reaction control compared to the copolymers. Furthermore, the thermoresponsive behavior of rPEGs in aqueous solution was investigated by turbidimetry and ESR. Turbidimetric measurements were performed at concentrations of 5 mg mL-1 and 100 mg mL-1, while ESR measurements were performed at 100 mg mL-1. At a concentration of 5 mg mL-1, cloud points could be measured turbidimetrically for copolymers of molar fractions above 40 mol % and ranged between 96 °C and 70 °C. At concentrations of 100 mg mL-1, cloud points were determined between 86 °C and 68 °C by turbidimetry and show good accordance with the onset of chain collapse and the formation of hydrophobic segments observed in the EPR measurements. Even at high concentrations, all polymers showed cloud points above 60 °C, providing no indication of macroscopic phase separation in the range of physiologically relevant temperatures. Chapter 3 examines the functionalization of the copolymers with a fluorescent dye, specifically to enable studies via fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and microscale thermophoresis, (MST) regarding the binding affinity of monoclonal backbone-specific anti-PEG Immunoglobulin G (IgG) antibodies to rPEGs of constant molar mass and varying molar GME content under in vitro conditions. The obtained results showed a steadily decreasing antigenicity of the copolymers with increasing molar content of GME substantiated by a decreasing change in hydrodynamic radius when exposing rPEGs to anti-PEG IgG up to concentrations of 5 μM as well as a strong increase in the dissociation constant Kd for higher molar contents of GME in the copolymer backbone. While reduced binding affinity was observed for copolymers with molar GME contents up to 42 mol%, a copolymer with a molar GME content of 52 mol% yielded no detectable antibody binding even at high ligand concentration. The focus of Chapter 4 is placed on the synthesis of rPEGs with lipid functionalization and analysis of the protein corona formed by particles coated with these copolymers upon exposure to human serum. To achieve full functionalization, a lipid initiator was synthesized, and AROP was performed under adapted conditions to accommodate for reactivity and solubility of this initiator. The prepared lipids of constant chain length and varying molar amounts of GME were coated onto nanocarriers so the effect of the rPEG backbone on the formation of the protein corona could be observed. Although overall protein concentration in the corona was found to be significantly lower for the particles coated with the synthesized samples compared to Lutensol AT50, the relative abundance of anti-PEG IgG in total IgG was higher for all synthesized samples and remained approximately constant for varying molar contents of GME in the copolymers. The lowest total concentration of IgG in the protein corona was found for the sample with the highest molar content of GME. At the same time, this sample showed increased concentrations of opsonins in the corona, while dysopsonins were most abundant in samples with low molar GME content. It was concluded that the unexpectedly low packing density of the synthesized rPEGs on the particle surface had a strong influence on the formation of the protein corona so that only general trends in the composition could be observed while the precise influence of the molar GME content on the composition of the corona could not be conclusively determined. Appendix Chapter 1 introduces the fundamental concept of rPEGs and provides the basis for the investigations carried out in this work. Successful synthesis of rPEGs under AROP conditions was shown for copolymers up to a GME content of 74 mol% through analysis via 1H NMR and DOSY NMR spectroscopy, SEC and MALDI TOF. Statistical calculations provided insight into the diminished occurrence of epitopes containing 16 or more consecutive EO units for rPEGs with increasing GME content. First turbidimetric measurements showed no phase separation for any of the polymers in aqueous solution below 70 °C for concentrations of up to 10 mg mL-1. Cell viability and B cell activation as well as hemocompatibility in human blood in vitro were demonstrated for the rPEG samples and showed comparable values to mPEG. Competitive backbone-selective and end group-selective APA ELISAs were able to demonstrate a stark reduction in relative antibody affinity to rPEGs with increasing molar GME content compared to mPEG.

Polyether zählen zu den wichtigsten Materialien in der modernen Medizin. Der prominenteste Vertreter dieser Verbindungsklasse ist Poly(ethylenglykol) (PEG) mit einer weltweiten Produktion von 2.5 Millionen Tonnen im Jahr 2022. PEG wird durch die anionische Ringöffnungs-Polymerisation (AROP) von Ethylenoxid (EO) erhalten und zeigt außergewöhnliche Eigenschaften: es ist wasserlöslich, biokompatibel und kann bis zu einem Molekulargewicht von 30 kDA vom Nierensystem des Menschen ausgeschieden werden. PEGylierung – der Prozess der Funktionalisierung von aktiven pharmazeutischen Ingredienzien (APIs) mit PEG – hat die Forschung bezüglich Wirkstofftransport in der medizinischen Wissenschaft seit ihrer Entdeckung in den 1970 er Jahren revolutioniert. Indem APIs mit einer Corona aus PEG umhüllt werden, wird die Immunreaktion auf diese Stoffe aufgrund der Inhibition der Opsonin Adsorption deutlich reduziert. Dieses Phänomen, bekannt als “stealth effect”, verlängert die Zirkulationszeit von PEGylierten Verbindungen im Blutkreislauf erheblich verglichen mit unmodifizierten. Im März 1990 wurde das erste PEGylierte Protein (Adagen® von Enzon Pharmaceuticals) von der Food and Drug Administration (FDA) für die Anwendung zugelassen und seitdem wurden Dutzende mehr auf den Markt gebracht. Trotz dieser Fortschritte wurde die Entdeckung des „stealth“ Effekts kurze Zeit später mit dem Nachweis von anti-PEG-Antikörpern (APAs) konfrontiert. Diese Antikörper können chronische negative Reaktionen gegen PEG hervorrufen, die bis zu hypersensitiven Reaktionen ähnlich einem anaphylaktischen Schock reichen können. Eine kürzlich durchgeführte Studie fand ein Auftreten von APAs in bis zu 83 % der deutschen Gesamtbevölkerung. Dies hebt die Notwendigkeit einer Alternative zu PEG hervor, die weiterhin zur Reduktion von Immunreaktionen beiträgt und gleichzeitig dessen vorteilhaften Eigenschaften erhält. Unsere Forschungsgruppe hat vor Kurzem die Synthese eines Copolymers aus EO und Glycidylmethylether (GME) mit statistisch verteilter Monomersequenz entwickelt, die eventuell eine sinnvolle Alternative zu PEG im Falle von schweren Immunreaktionen darstellen kann. Diese „rPEGs“ (random PEGs) sind Strukturisomere zu PEG, besitzen aber zufällig verteilte Seitenketten entlang des Polymerrückgrats, die potenziell die Bindung zu Antikörpern verhindern können. Copolymere mit GME konnten zuvor nicht unter den Bedingungen der „good manifacturing practice“ (GMP) hergestellt werden, wodurch sie von biomedizinischen Anwendungen ausgeschlossen waren. Wir haben diese Copolymere nun erfolgreich unter denselben AROP-Bedingungen hergestellt, die auch für die Synthese von GMP-zertifiziertem PEG verwendet werden und eröffnen damit die Möglichkeit einer medizinischen Applikation. Diese Arbeit behandelt die Synthese von rPEGs unter den genannten AROP-Bedingungen, ihre Funktionalisierung durch polymeranaloge Reaktionen, Untersuchungen ihrer physikochemischen Eigenschaften sowie ihr Verhalten gegenüber Antikörpern und Proteinen unter in vitro-Bedingungen. Kapitel 1 umfasst die theoretischen Grundlagen über die Synthese von Polyethern, deren Eigenschaften und ihre Anwendung wobei der Schwerpunkt auf PEG liegt. Zusätzlich werden das generelle Konzept der PEGylierung und das Phasenverhalten von Polyethern in wässriger Lösung diskutiert. Kapitel 2 beschäftigt sich mit der Synthese des Monomers GME und seinem Copolymerisationsverfahren mit EO. Mehrere Copolymere mit konstanter Kettenlänge und variierenden molaren Anteilen von GME wurden hierfür hergestellt und charakterisiert. Weiterhin wurde das thermoresponsive Verhalten von rPEGs in wässriger Lösung mit Hilfe von Turbidimetrie und Elektronenspinresonanz (electron paramagnetic resonance, EPR) untersucht. Die Resultate beider Methoden zeigten eine deutliche Abhängigkeit der Trübungspunkte vom molaren Gehalt von GME in den Copolymeren. Diese liegen in guter Übereinstimmung mit dem Einsetzen des Kettenkollaps und der Bildung hydrophober Segmente in den Copolymeren, die während der EPR-Messungen beobachtet wurden. Selbst bei hohen Konzentrationen zeigten alle Polymere Trübungspunkte jenseits von 60 °C und zeigen daher keine Anzeichen makroskopischer Phasentrennung im Bereich von physiologisch relevanten Temperaturen. In Kapitel 3 wird die Funktionalisierung der Copolymere mit einem fluoreszierenden Farbstoff behandelt. Diese wurde durchgeführt, um Untersuchungen der Bindungsaffinität von monoklonalem Rückgrat-spezifischem anti-PEG-Immunoglobulin G (IgG) Antikörpern mit rPEGs von konstanter Molmasse und variierender molarer Anteile von GME mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) und Microscale Thermophorese (MST) unter in vitro-Bedingungen zu ermöglichen. Die Ergebnisse, die mittels FCS und MST erhalten wurden, zeigen einen stetigen Abfall der Antigenität der Copolymere mit einem steigenden molaren Anteil von GME, demonstriert durch abnehmende Änderung des hydrodynamischen Radius bei einer Exposition der rPEGs gegenüber anti-PEG IgG für Konzentrationen bis zu 5 μM, sowie durch eine starke Zunahme der Dissoziationskonstante Kd für steigende molare Anteile von GME im Polymerrückgrat. Während für Copolymere mit einem molaren GME-Anteil von bis zu 42 mol% eine reduzierte Bindungsaffinität beobachtet werden konnte, so konnte für das Copolymer mit einem molaren GME-Anteil von 52 mol% keine nachweisbare Antikörperbindung mehr nachgewiesen werden. Der Fokus von Kapitel 4 liegt auf der Synthese einiger Lipid-funktionalisierter rPEGs und der Analyse der Proteincorona, die von Partikeln bei Exposition gegenüber Humanserum gebildet wird, wenn diese mit den Copolymeren beschichtet sind. Mit den synthetisierten Lipiden mit konstanter Kettenlänge und variierendem molaren GME-Anteil wurden Nanocarrier beschichtet, sodass der Effekt des rPEG-Rückgrats auf die Proteincorona analysiert werden konnte. Obwohl die gesamte Konzentration von Proteinen in der Corona deutlich niedriger war für die mit rPEG beschichteten Partikel, wurde die relative Häufigkeit von anti-PEG IgG in der Gesamtmenge IgG für alle synthetisierten Proben höher bestimmt als im Vergleich zu den Lutensol AT50-Proben und blieb annähernd konstant für verschiedene molare Anteile von GME in den Copolymeren. Die niedrigste Konzentration von IgG wurde für die Probe mit dem höchsten molaren Anteil von GME nachgewiesen, welche allerdings erhöhte Mengen an Opsoninen in der Corona aufwies, während Dysopsonine am häufigsten in Proben mit niedrigen GME-Anteilen gefunden wurden. Die Schlussfolgerung wurde gezogen, dass die unerwartet niedrige Beschichtungsdichte der synthetisierten rPEGs auf der Partikeloberfläche einen wesentlichen Einfluss auf die Bildung der Proteincorona hatte, sodass lediglich generelle Trends in der Zusammensetzung beobachtet werden konnten. Anhang Kapitel 1 gibt eine Einführung in das Konzept von rPEGs und liefert die Grundlage für die Untersuchungen, die in dieser Arbeit vorgenommen wurden. Die erfolgreiche Synthese und Charakterisierung unter AROP-Bedingungen wurde für rPEGs mit einem molaren GME-Anteilmvon bis zu 74 mol% durchgeführt. Statistische Auswertung bot eine Einsicht in das bei hohen GME-Anteilen verminderte Auftreten von größeren EO-Epitopen. Erste turbidimetrische Messungen zeigten keine Phasenseparation unterhalb von 70 °C für wässrige Lösungen der Polymere bis zu einer Konzentration von 10 mg mL-1. Zellviabilität und B-Zellen-Aktivierung der rPEG-Proben sowie deren in vitro Hemokompatibilität in menschlichen Blutproben wurde demonstriert und zeigte vergleichbare Werte zu mPEG. Kompetitive Rückgrat-selektive und Endgruppen-selektive APA ELISAs konnten eine deutliche Reduktion der relativen Antikörper-Affinität zu rPEGs mit steigendem GME-Anteil im Vergleich zu mPEG zeigen.