Sex chromosome dosage compensation in non-model insects

Abstract

Sexual reproduction is common among animals. The sex of the animal is often determined by sex chromosomes. Differentiated sex chromosomes evolve from autosomal progenitors, when one chromosome from the pair gains a sex-determining region and loses its genetic activity over time. Degeneration of the Y chromosome effectively leads to aneuploidy of the X chromosome in males. The resulting gene dosage imbalance can be detrimental and is frequently corrected by a mechanism named dosage compensation (DC). Understanding dosage compensation and other molecular differences between sexes is highly relevant. For example, only the female mosquitos bite and transmit the malaria parasite. The mechanism regulating DC in Anopheles gambiae, the major vector of malaria, was unknown when I began my PhD work. To identify putative DC factors, I generated a sex-specific RNA expression atlas along embryogenesis. I observed that DC initiates shortly after zygotic genome activation. I then discovered a previously uncharacterized gene with consistently male-biased expression: AGAP005748. Based on its suspected function, I named this gene SOA (sex chromosome activation). I discovered that SOA produces two sex-specific, alternatively spliced isoforms. Males express a canonical transcript, while in females the second intron is retained. Intron inclusion results in a premature stop codon and production of a truncated protein in females. I discovered that SOA binds the promoters of expressed X-linked genes in mosquito males. Next, I aimed to assess the effect of SOA on gene expression. I observed that SOA expressed ectopically in a female cell line binds gene promoters of active X-linked genes resulting in their upregulation. To comprehend its physiological function, our collaborator dr. Eric Marois generated transgenic mosquitoes devoid of SOA through a CRISPR-mediated knock-in of a gene trap upstream of the coding sequence (SOA-KI). In these mosquitos, I detected a loss of signal at SOA binding sites. Additionally, RNA-seq revealed downregulation of the X chromosome in SOA mutant males, confirming SOA indeed mediates DC in vivo. Surprisingly, SOA-KI mosquitos of both sexes are viable. Male SOA-KI pupae exhibited a developmental delay compared to wild-type, while females were unaffected. We also generated a transgenic line called SOA-R that expresses the full-length SOA cDNA. In female mosquitoes carrying this allele SOA also binds and upregulates X-linked genes. The insights from this work, especially the discovery of non-essentiality of DC in Anopheles have made me even more interested in the evolution of this process. Because of this, I surveyed the published works investigating the DC status and mechanism in different species. I wrote a review article summarizing the knowledge about sex chromosome evolution and DC in insects. In this article, I also used the insights from my previous work to provide guidance to researchers who aim to identify DC mechanisms in other insect species. In my PhD work, I demonstrated that SOA is the master regulator of X chromosome dosage compensation in A. gambiae. I also summarized the knowledge about the DC status across insects and proposed a framework to uncover the DC factors in non-model insect species.

Die geschlechtliche Fortpflanzung ist bei Tieren weit verbreitet, und das Geschlecht wird oft durch Geschlechtschromosomen bestimmt. Diese entwickeln sich aus einem Paar autosomaler Vorfahren, wobei ein Chromosom eine geschlechtsbestimmende Region erhält und im Laufe der Zeit genetische Aktivität verliert. Die Degeneration des Y-Chromosoms führt bei Männchen effektiv zu einer Aneuploidie des X-Chromosoms. Dieses Ungleichgewicht in der Gendosierung kann schädlich sein und wird häufig durch einen Mechanismus namens Dosiskompensation (DC) ausgeglichen. Das Verständnis der DC und anderer molekularer Unterschiede zwischen den Geschlechtern ist von großer Bedeutung, da diese Mechanismen oft geschlechtsspezifische Eigenschaften und Funktionen steuern. Beispielsweise sind es nur die weiblichen Stechmücken, die den Malariaparasiten übertragen. Zu Beginn meiner Doktorarbeit war der Mechanismus, der die DC in Anopheles gambiae, dem Hauptüberträger der Malaria, steuert, noch unbekannt. Um potenzielle DC-Faktoren zu identifizieren, erstellte ich einen geschlechtsspezifischen RNA-Expressionsatlas der den Verlauf der Embryogenese abdeckt. Ich stellte fest, dass der Dosierungsausgleich kurz nach der Aktivierung des zygotischen Genoms einsetzt. Dabei entdeckte ich ein zuvor uncharakterisiertes Gen mit durchweg männlich geprägter Expression: AGAP005748. Aufgrund seiner anzunehmenden Funktion nannte ich dieses Gen SOA (Sex Chromosome Activation). Es stellte sich heraus, dass SOA zwei geschlechtsspezifische, alternativ gespleißte Isoformen produziert. Bei Männchen wird ein kanonisches Transkript exprimiert, während bei Weibchen das zweite Intron erhalten bleibt. Der Einschluss dieses Introns führt zu einem vorzeitigen Stoppcodon und zur Produktion eines verkürzten Proteins bei Weibchen. Ich konnte zeigen, dass SOA an die Promotoren von X-chromosomalen Genen in männlichen Moskitos bindet. Anschließend untersuchte ich die Auswirkungen von SOA auf die Genexpression. Dabei stellte ich fest, dass SOA, wenn es ektopisch in einer weiblichen Zelllinie exprimiert wird, an die Promotoren aktiver X-chromosomaler Gene bindet und deren Hochregulierung bewirkt. Um die physiologische Funktion von SOA zu verstehen, SOA zu verstehen, generierte unser Kollaborationspartner Dr. Eric Marois transgene Moskitos, bei denen, bei denen durch ein CRISPR-generiertes Knock-in vor der kodierenden Sequenz das Gen SOA ausgeschaltet wurde (SOA-KI). In diesen Mücken stellte ich einen Signalverlust an den SOA-Bindungsstellen fest. Darüber hinaus ergab eine RNA-seq-Analyse eine Herabregulierung von X-chromosomalen Genen in SOA-KI-Männchen, was bestätigt, dass SOA tatsächlich in vivo die DC vermittelt. Überraschenderweise waren SOA-KI-Mücken beiderlei Geschlechts lebensfähig. Allerdings zeigten männliche SOA-KI-Puppen im Vergleich zum Wildtyp eine Entwicklungsverzögerung, während Weibchen nicht betroffen waren. Zusätzlich erzeugten wir eine transgene Linie namens SOA-R, die SOA-cDNA exprimiert. Weibliche Stechmücken, die dieses Allel tragen, banden SOA ebenfalls an das X-Chromosom und zeigten sie eine erhöhte X-chromosomale Genexpression. Die Erkenntnisse aus meiner Forschung, insbesondere die Entdeckung der Nichtessentialität der DC bei Anopheles, haben mein Interesse an der Evolution dieses Prozesses weiter vertieft. Daher habe ich die verfügbaren Studien zum DC-Status und dessen Mechanismen in verschiedenen Arten untersucht. Auf dieser Basis verfasste ich einen Übersichtsartikel, der das Wissen über die Evolution der Geschlechtschromosomen und der Dosiskompensation bei Insekten zusammenfasst. Darin habe ich auch Erkenntnisse aus meiner eigenen Arbeit integriert, um anderen Forschenden, die den DC-Mechanismus bei weiteren Insektenarten erforschen möchten, eine Hilfestellung zu bieten. In meiner Dissertation habe ich dargelegt, dass SOA der Hauptregulator der DC des X-Chromosoms in A. gambiae ist. Darüber hinaus habe ich das Wissen über den DC-Status bei Insekten zusammengefasst und einen Rahmen vorgeschlagen, um DC-Faktoren auch in Nicht-Modell-Insektenarten zu identifizieren.