Untersuchung zellfreier DNA auf epigenetische Biomarker bei Small Fiber Neuropathie
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Die Small-Fiber-Neuropathie ist eine langsam progrediente Erkrankung, die durch die Nerven-schädigung sowie den Untergang von kleinen unmyelinisierten peripheren Nervenfasern, den sogenannten Aδ- und C-Fasern, verursacht wird. Diese finden sich z.B. in der Haut sowie in peripheren Nerven und diversen Organen (Themistocleous et al., 2014). Betroffene zeigen meist brennende Schmerzen akral sowie in den unteren Extremitäten (Sommer and Üçeyler, 2018). Die aktuelle Diagnostik der SFN fußt u.a. auf quantitativen sensorischen Tests aber v.a. auf der Entnahme einer Hautstanzbiopsie zur Diagnosesicherung (Sommer and Üçeyler, 2018). Da die Hautstanzbiopsie nicht bei allen Patienten anwendbar ist und mit Schmerzen sowie Komplikationen verbunden sein kann, wurde im Rahmen dieser Arbeit nach einer Mög-lichkeit gesucht, eine Methode zu etablieren, bei der die Small Fiber Neuropathie mithilfe einer einfachen Blutentnahme anhand epigenetischer Biomarker diagnostiziert werden kann. Dafür wurden insgesamt vier Regionen in den Promotorregionen der Gene SCN9A, SCN10A und SCN11A untersucht, die für Untereinheiten der Nav-Kanäle Nav1.7, 1.8 und 1.9 codieren und spezifisch in C-Fasern exprimiert werden. Dabei wurden die Methylierungsverhältnisse der ausgewählten Genabschnitte zwischen gesunden Kontroll-Personen und an SFN erkrankten Patienten verglichen. DNA-Methylierung ist eine epigenetische Modifikation, kann vererbt wer-den und findet meist an CpG-Positionen statt (Walter, 2018). Daher wurden für die Suche nach einem epigenetischen Biomarker CpG-Positionen im Bereich der Promotorregionen der ge-nannten Gene untersucht. Als weitere Kontrolle dienten zudem Proben von Hautstanzbiopsien von Patienten, die die Methylierungsverhältnisse der Zellen der Epidermis und Dermis darstel-len sollten. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass sich die Promotorregion der genannten Gene, da diese C-Faser spezifisch sind, in Gewebe anderen Ursprungs methyliert und somit transkriptiv stillgelegt vorfinden, in den C-Fasern selbst jedoch unmethyliert und aktiv sind. Dieser Hypothese zufolge sollte der cfDNA-Anteil von C-Fasern im Blut der an SFN erkrankten Patienten höher sein als bei den gesunden Kontrollpersonen, da bei diesen vermehrt C-Fasern untergehen. Somit wäre bei den an SFN erkrankten Patienten mit einer Hypomethylierung der untersuchten Regionen im Vergleich zu den gesunden Kontrollpersonen zu rechnen. Zur Ana-lyse der DNA-Methylierung wurde eine Methode basierend auf der Einzelklonsequenzierung von aus dem Blutplasma isolierter, bisulfit-konvertierter und PCR-amplifizierter cfDNA mit an-schließender Sequenzierung genutzt. Die Methylierungsverhältnisse wurden daraufhin auf drei Ebenen analysiert, auf der Ebene des Methylierungs-contents, der Methylierungslevel und der Methylierungsmuster. In Zusammenschau der Ergebnisse dieser drei Analyse-Ebenen ergab sich v.a. für die Regionen SCN9A2 und SCN11A1 eine deutliche Hypomethylierung einer der beiden untersuchten Plasma-Patienten-Proben den Kontroll-Proben gegenüber. Daher konnte die Annahme getroffen werden, dass sich diese beiden Loci gut für die Etablierung eines epi-genetischen Biomarkers bei SFN eignen. Die beiden im Rahmen dieser Arbeit analysierten Plasma-Patienten-Proben zeigten an beiden relevanten Genloci deutliche Unterschiede ihren Methylierungsgrad betreffend. So wies eine der beiden (P1) eine Hypomethylierung auf, die andere (P2) jedoch zeigte sich von ihrer Methylierung her auf einem ähnlichen Niveau wie die Kontroll-Proben. Es wurde daher die Theorie aufgestellt, dass sich die beiden Patienten in ih-rem Krankheitsstadium unterscheiden bzw. sich der eine (P2) bei Probenentnahme nicht in einem Krankheitsschub befand und daher deren Ergebnisse so stark voneinander abwichen. Deshalb wäre für weiterführende Untersuchungen die Analyse der Genloci SCN9A2 und SCN11A1 bei einer größeren Patientenanzahl sowie Patienten in einem unterschiedlichen Krankheitsstadium nötig. Die anderen beiden Genloci, die im Rahmen dieser Arbeit ausgewer-tet wurden zeigten entweder eine insgesamt sehr geringe bis keine Methylierung (SCN9A1) oder eine Hypermethylierung der Plasma-Patienten-Proben gegenüber den Kontrollen (SCN10A2), sodass diese als epigenetische Biomarker bei SFN wahrscheinlich eher nicht ge-eignet waren. Allerdings bestand bei beiden die Möglichkeit, dass es sich um Bindestellen für Transkriptionsrepressoren handelt, weshalb bei SCN9A1 die Methylierungsanalyse von Plas-ma-Patienten-Proben und bei beiden eine bioinformatische Analyse nötig wäre, um endgültig die Eignung als epigenetischer Biomarker zu klären. Die Biopsie-Proben zeigten sich in ihren Ergebnissen durchwachsen, bei SCN9A1, SCN11A1 und der letzten der drei bei SCN10A2 untersuchten CpG-Positionen näherten sie sich erwartungsgemäß den Werten der Blutplasma-Kontrollen an; an den anderen CpG-Positionen von SCN10A2 sowie bei SCN9A2 zeigten sie jedoch keine Annäherung oder auch starke Abweichungen in ihrer Methylierung. Ob anhand dieser Proben valide Aussagen getroffen werden können, war daher unklar.
Um die beiden Genloci SCN9A2 und SCN11A1 als epigenetische Biomarker zu etablieren, müsste eine größere Patientenzahl untersucht werden. Nach Etablierung der Biomarker könn-te dann eine kosten- und zeiteffizientere Methode zur Detektion des Methylierungsstatus an-gestrebt werden, wie beispielsweise die MSP oder die Pyrosequenzierung. Auch Genexpres-sionsanalysen sowie die Analyse von cfDNA fragmentation patterns anhand einer Liquid Bi-opsy könnten Potenzial für weitere Forschung in diesem Thema bergen.