Identification and characterization of the 21U RNA processing enzyme in Caenorhabditis elegans

Abstract

The piRNA pathway is a widely-represented, small RNA-based mechanism that takes part in transposon silencing. It is mostly active in the germline and early embryos. Even though the piRNA pathway is present in many species, mechanistic details of the pathway vary significantly. For instance, in many animals piRNAs are produced from long precursor transcripts that are processed afterward to form multiple mature piRNAs, whereas in C. elegans piRNA precursors are transcribed from individual loci that each produce a single piRNA. PiRNAs in C. elegans are called 21U RNA, because they are 21 nucleotide long and have strong 5’ U bias. 21U RNA precursors are roughly 28 nt long and contain a 5’ cap. To become a 21U RNAs, these precursors undergo maturation both at the 5’ and 3’ end. The mechanism of the 5’ end processing of 21U RNA precursors in C. elegans is yet unknown. Our lab previously identified a protein complex, named PETISCO, that binds 21U RNA precursors and is required for their processing. Interestingly, PETISCO has two mutually exclusive interactors: PID-1 and TOST-1. PID-1-PETISCO only plays a role in 21U RNA maturation, while TOST-1-PETISCO has a different and still unknown maternal essential function, but does not affect 21U RNA biogenesis. However, how PETISCO can help 21U RNA production is still unclear. I started with the purification of PETISCO proteins and obtained working antibodies against TOFU-6, IFE-3, and PID-3. In collaboration with Sebastien Falk (Vienna), the crystal structure of PETISCO was obtained and the effects of the disrupting interactions within PETISCO were tested in vivo. In my second project, I identified a novel nuclease complex, which had been named PUCH (Precursor of 21U 5’ end Cleavage Holoenzyme), with an essential role in piRNA precursor processing. PUCH is characterized by three subunits, TOFU-1, TOFU-2, and one of the newly identified 21U RNA pathway factors SLFL-3 or SLFL-4. The active center of PUCH is formed by Schlafen-like domains, present in all four proteins. I proved the activity of PUCH in vivo and in vitro. Analysis of the substrate requirements showed that PUCH needs m7G-cap and U in position three to perform the cleavage. Again, in collaboration with Sebastian Falk, the link between PETISCO and PUCH was identified. Interaction between TOFU-6 and TOFU-1 was demonstrated in vitro and crystal 9 structure of this interaction was obtained. CRISPR/CAS9 genome editing we disrupted the interaction between PUCH and PETISCO and confirmed the relevance of this interaction for 21U RNA maturation in vivo. Thus, I identify PUCH as a novel 5’ end processing complex that drives piRNA precursor maturation in C. elegans, in conjunction with the precursor-binding complex PETISCO. The catalytic center of PUCH consists of three different SLFN domains. Given the multitude of non-characterized SLFN homologs in mammalian genomes, PUCH may define a novel type of multi-subunit nuclease enzymes with many different yet unknown functions.

Der piRNA-Signalweg ist ein weit verbreiteter, auf kleinen RNAs basierender Mechanismus, der am Transposon-Silencing beteiligt ist. Er ist hauptsächlich in der Keimbahn und in frühen Embryonen aktiv. Obwohl der piRNA-Signalweg in vielen Spezies konserviert vorkommt, unterscheiden sich die mechanistischen Details erheblich. in vielen Tieren werden piRNAs aus langen Vorläufertranskripten gebildet, die nachfolgend zu mehreren reifen piRNAs prozessiert werden, während in C. elegans piRNA-Vorläufer von einzelnen Loci transkribiert werden, die nur jeweils eine einzelne piRNA produzieren. In C. elegans werden piRNAs auch als 21U-RNA bezeichnet, da sie 21 Nukleotide lang sind und einen starken Uracil-Bias am 5’-Ende aufweisen. Deren Vorläufer sind etwa 28 nt lang und enthalten eine 5'-Kappe. Um zu einer 21U-RNA zu werden, durchlaufen diese Vorläufer sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende eine Reifeprozessierung. Der Mechanismus zur Prozessierung des 5'-Endes von 21U-RNA-Vorläufern in C. elegans ist noch unbekannt. In vorausgegangenen Arbeiten konnte in unserem Labor bereits einen Proteinkomplex namens PETISCO identifiziert werden, der 21U-RNA-Vorläufer bindet und für deren Reifung erforderlich ist. Interessanterweise hat PETISCO zwei sich gegenseitig ausschließende Interaktoren: PID-1 und TOST-1. PID-1-PETISCO spielt nur bei der 21U-RNA-Reifung eine Rolle. TOST-1-PETISCO hingegen hat eine andere, noch unbekannte, jedoch mütterlicherseits essentielle Funktion, die aber die 21U-RNA-Biogenese nicht beeinflusst. Wie PETISCO zur 21U-RNA-Produktion beitragen kann, ist noch unklar. In meiner Arbeit begann ich mit der Aufreinigung von PETISCO-Proteinen und erstellte funktionierende Antikörper gegen TOFU-6, IFE-3 und PID-3. In Zusammenarbeit mit Sebastien Falk (Wien) wurde die räumliche Struktur von PETISCO aufgeklärt und die Auswirkungen der Wechselwirkungen mit störenden Interaktoren von PETISCO in vivo getestet. In einem weiteren Projekt beschäftigte ich mich mit der Identifikation eines neuartigen Nukleasekomplex, der den Namen PUCH (Precursor of 21U 5'-end Cleavage Holoenzyme) erhielt und eine wesentliche Rolle bei der Prozessierung von piRNA-Vorläufern spielt. PUCH besteht aus drei Untereinheiten, TOFU-1, TOFU-2 und einem der beiden neu identifizierten Fraktoren des 21U-RNA-Signalwegs, SLFL-3 oder SLFL-4. Das aktive Zentrum von PUCH wird durch “Schlafen”-ähnliche Domänen gebildet, die in allen vier Proteinen vorhanden sind. Die enzymatische Aktivität 11 von PUCH konnte ich in vivo und in vitro nachweisen. Eine Analyse der Substratanforderungen zeigte, dass PUCH eine m7G-cap-Struktur sowie Uracil in Position drei der piRNA benötigt, um eine Spaltung durchzuführen. Ebenfalls in Zusammenarbeit mit Sebastian Falk wurde die Beziehung zwischen PETISCO und PUCH untersucht. Die Interaktion zwischen TOFU-6 und TOFU-1 wurde in vitro nachgewiesen und die Kristallstruktur dieser Proteine während der Interaktion konnte aufgeklärt werden. Durch CRISPR/CAS9 Genomeditierung wurde die Interaktion zwischen PUCH und PETISCO gestört und die Bedeutung dieser Interaktion für die 21U RNA-Reifung in vivo bestätigt. Somit wurde PUCH, in Verbindung mit PETISCO, als neuartiger Prozessierungskomplex des 5'-Endes bei der Reifung von piRNA-Vorläufern in C. elegans identifiziert. Das katalytische Zentrum von PUCH setzt sich aus drei verschiedenen SLFN-Domänen zusammen. Angesichts der Vielzahl nicht charakterisierter SLFN-Homologe in Säugetieren könnte PUCH eine neue Art von Nuklease-Enzymen mit mehreren Untereinheiten und vielen verschiedenen, bisher unbekannten Funktionen darstellen.