Quantitative interactomics screen reveals the role of the lncRNA ANRIL during viral infection

Abstract

Recent advances in deep sequencing technologies have revealed that while only 2-5% of the human genome encodes protein-coding genes, an estimated 80% of these genes are actively transcribed into a variety of non-coding RNAs. Among these, long non-coding RNAs represent a major subclass, with over 35,000 annotated genes. Despite their abundance, most of these genes remain functionally uncharacterized. The antisense non-coding RNA in the INK4 locus (ANRIL) is transcribed from the disease-associated hotspot 9p21.3, which has been implicated in cancer development and cardiovascular disorders, yet its molecular functions remain poorly defined. To systematically characterize ANRIL, a quantitative mass spectrometry-based interactomics screen using 14 nonoverlapping RNA fragments covering the longest ANRIL isoforms was performed. This strategy identified 310 interacting proteins, each exhibiting distinct binding patterns across different fragments, revealing both previously described and yet unknown interactors. Among the newly identified proteins, the uncharacterized protein C7orf50 bound to two ANRIL fragments. Functional characterization revealed an enrichment of C7orf50 interactors involved in ribosomal biogenesis, including known ANRIL-binding members of the PeBoW complex. These findings suggest a potential role of C7orf50 during ribosomal maturation and indicate an additional target of ANRIL-mediated regulation during ribosome biogenesis. Furthermore, computational analysis of the ANRIL interactome recapitulated previously reported biological functions, such as chromatin remodeling, while also suggesting previously unrecognized roles in virus infection. Interestingly, ANRIL knockdown led to altered expression of genes associated with interferon signaling and viral entry. Infection studies with dsDNA and ssRNA viruses resulted in virus-specific modulation of ANRIL expression. Notably, ANRIL was upregulated in response to cedar virus (CedV) infection in a time- and dose-dependent manner. Transcriptomic analysis revealed a concurrent increase in immune response genes, particularly those involved in type I interferon signaling. Furthermore, ANRIL lockdown led to increased CedV RNA levels and titers, demonstrating a link between ANRIL and viral infection. Preliminary mechanistic insights indicated that the knockdown of the newly identified ANRIL-interacting protein INO80 also increased CedV RNA levels. However, further analyses are required to determine the precise molecular mechanisms involved. Overall, the unbiased RNA-protein interaction screen provides insights into how ANRIL mediates various cellular functions through protein interactions and paves the way for future investigations into the role of ANRIL in health and disease.

Neue Fortschritte in der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie haben gezeigt, dass lediglich 2-5% des menschlichen Genoms für proteinkodierenden Gene verantwortlich sind, während schätzungsweise 80% aktiv in nicht-kodierende RNAs transkribiert werden. Ein Großteil davon sind, mit über 35.000 annotierten Genen, lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs). Trotz ihrer Häufigkeit sind die meisten jedoch bislang funktionell kaum bis gar nicht charakterisiert. Die Antisense-nicht-kodierende RNA im INK4-Locus (ANRIL) wird aus dem krankheitsassoziierten Hotspot 9p21.3 transkribiert, der mit der Entstehung von Krebs und kardiovaskulären Erkrankungen in Verbindung gebracht wird. Dennoch sind die molekularen Funktionen von ANRIL bislang weitgehend unklar. Zur Charakterisierung von ANRIL wurde ein quantitativer, Massenspektrometrie basierter Interaktom-Screen mit 14, sich nicht überlappenden, RNA-Fragmenten der längsten ANRIL-Isoform durchgeführt. Dadurch wurden 310 ANRIL-interagierende Proteine identifiziert, die jeweils unterschiedliche Bindungsmuster aufwiesen. Darunter sowohl bereits bekannte ANRIL bindende Proteine, als auch bislang nicht identifizierte Interaktionspartner. Unter diesen neu identifizierten Proteinen zeigte das bislang weitestgehend uncharakterisierte Protein C7orf50 eine spezifische Bindung an zwei ANRIL-Fragmenten. Analysen zur Funktionscharakterisierung ergaben eine Anreicherung von C7orf50-Interaktionspartnern, die an der Ribosomenbiogenese beteiligt sind, darunter auch bekannte ANRIL-Bindungspartner des PeBoW-Komplexes. Die Ergebnisse deuten auf eine mögliche Rolle von C7orf50 bei der Ribosomenreifung hin und legen nahe, dass ANRIL über die Interaktion mit C7orf50 ebenfalls in diesem Prozess eine regulatorische Funktion ausüben könnte. Zusätzliche bioinformatische Analysen des ANRIL-Interaktoms bestätigen bekannte biologische Funktionen und wiesen zugleich auf eine bislang unerforschte Rolle bei Virusinfektionen hin. Interessanterweise führte der Knockdown von ANRIL zu einer veränderten Expression von Genen, die mit dem Interferon-Signalweg sowie dem viralen Eintritt assoziiert sind. Infektionsstudien mit dsDNA und ssRNA Viren zeigten eine virusspezifische Modulation der ANRIL-Expression. In weiterführenden Experimenten mit dem ssRNA Cedar Virus (CedV), konnte eine zeit- und dosisabhängige Hochregulation von ANRIL beobachtet werden. Transkriptomanalysen ergaben eine gleichzeitige Induktion von immunregulierenden Genen, insbesondere solcher, die am Typ-I-Interferon-Signalweg beteiligt sind. Zudem führte die Runterregulierung von ANRIL mittels RNA Interferenz zu einem Anstieg der CedV-RNA-Menge und Virustiter, was eine Verbindung zwischen ANRIL und viraler Infektion nahelegt. Erste funktionelle Hinweise deuten darauf hin, dass die Runterregulierung des neu identifizierten ANRIL-Bindungspartners INO80 ebenfalls zu einem Anstieg der CedV-RNA-Menge führt. Der genaue molekulare Mechanismus bedarf jedoch weiterer Untersuchung. Insgesamt liefert der RNA-Protein-Interaktionsscreen Einblicke in die vielfältigen zellulären Funktionen von ANRIL, welche durch Proteininteraktionen vermittelt werden und ebnet den Weg für zukünftige Studien zur Rolle von ANRIL in Gesundheit und Krankheit.