Single cell profiling reveals modulatory effects of immunotherapeutic RNA approaches in cancer and autoimmune disease models

Abstract

This work focused on establishing a single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) pipeline for comprehensive immune cell analysis to reveal cell types and states as well as to dissect the gene expression (GE) and regulatory relationships between genes and cells in health and disease. Our scRNA-seq pipeline is based on the Chromium Controller, a device capturing and amplifying a minute amount of RNA and analysis tools for clustering (Seurat) and enriched pathways or genes (Cluster Profiler and gene set variation analysis). In this thesis, researchers used the pipeline to investigate the effects of immunotherapeutic RNA approaches in cancer and autoimmune disease models. Chapter one demonstrates the pipeline's ability to identify cell types and the robustness of the protocol through the consistent gene expression profiles of PBMC samples from the same donors. Comparisons between 3'gene expression protocol (3'GE) and 5'GE protocols showed no significant differences in cell composition and cell-type-specific genes. Therefore, single cell analysis pipeline based on 3’GE was applied to study transcriptional dynamics of immune cells in disease models for cancer and multiple sclerosis (MS) upon RNA vaccination in three different experimental settings: Chapter two describes the studies related to the adjuvant effect of RNA-Lipoplex (LPX) vaccination encoding the reporter gene enhanced green fluorescent protein (EGFP) on murine splenocytes, indicating an increase in the frequency of B cells and monocyte/granulocyte fraction. This led to the triggering of chemokines and inflammatory cytokines including upregulation of genes involved in interferon alpha (IFNα) and beta (INFβ) response, suggesting a heightened immune response and confirming the adjuvant effect of RNA by modulating innate immune system. Chapter three outlines the impact of autoantigen-encoding non-immunogenic RNA-LPX vaccination in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. A successful tolerance induction in EAE sick mice was observed in form of high effector regulatory T (Treg) cell frequencies using a myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide incorporated with 1-methylpseudouridine (MOG35_55_m1Ѱ). The main investigation for this thesis chapter was further to dissect the effect of MOG35-55_U in comparison to MOG35-55_m1Ѱ and irrelevant m1Ψ and to study functional differences with respect to inflammatory and immunosuppressive properties of the present CD4+ T cell subpopulations. MOG35-55_U in comparison to MOG35-55_ m1Ѱ led to downregulation of cell cycle genes and resulted into less cytotoxic signature but therefore higher level of stress was observed. MOG35_55_U as a more immunogenic mRNA construct did not lead to an enrichment of pathways demonstrating a (stronger) tolerance induction in EAE sick mice. Lastly, chapter four illustrates the therapeutic potential of liposomally-formulated RNA encoding the modified IL2var alone or in combination with a monoclonal antibody against programmed cell death 1 (aPD1) in a MC38 tumor mouse model to assess the immune response in CD45+ cells. The treatment demonstrated increased tumor infiltrating lymphocytes (TILs) frequency, a strong effector phenotype, reduction of exhaustion markers and an increased expression of transcription factors, suggesting a promising therapeutic cancer vaccine potential. In conclusion, the scRNA-seq pipeline developed in this thesis allowed in-depth analysis of individual cell subsets at single cell level and demonstrated the potential of various RNA-based treatments in cancer and autoimmune disease models. Further research is suggested to fully exploit the pipeline's capabilities and enhance therapeutic strategies.

Diese Arbeit konzentrierte sich auf die Etablierung einer Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) Pipeline für eine umfassende Analyse von Immunzellen, um Zelltypen und -Zustände aufzudecken sowie die Genexpression (GE) und regulatorische Beziehungen zwischen Genen und Zellen in Gesundheit und Krankheit zu untersuchen. Unsere scRNA-seq-pipeline basiert auf dem Chromium Controller, einem Gerät zur Erfassung und Amplifikation einer geringen Menge RNA, sowie auf Analysetools für das Clustering (Seurat) und angereicherte Signalwege oder Gene (Cluster Profiler und Gen-Set-Variationsanalyse). In dieser Arbeit nutzten die Forscher die Pipeline, um die Auswirkungen immuntherapeutischer RNA-Ansätze in Krebs- und Autoimmunkrankheitsmodellen zu untersuchen. Kapitel eins zeigt die Fähigkeit der Pipeline, Zelltypen zu identifizieren und die Robustheit des Protokolls durch die konsistenten Genexpressionsprofile von PBMC-Proben derselben Spender. Vergleiche zwischen 3'-Genexpressionsprotokoll (3'GE) und 5'-GE-Protokollen zeigten keine signifikanten Unterschiede in der Zellzusammensetzung und den zelltypspezifischen Genen. Daher wurde die Einzelzellanalyse-Pipeline auf der Grundlage von 3'-GE angewendet, um die Transkriptionsdynamik von Immunzellen in Krankheitsmodellen für Krebs und Multiple Sklerose (MS) nach RNA-Impfung in drei verschiedenen experimentellen Einstellungen zu untersuchen. Kapitel zwei beschreibt die Studien zur adjuvanten Wirkung der RNA-Lipoplex (LPX)-Impfung, die für das Reportergen Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) kodiert, auf Mäusesplenozyten, die eine Erhöhung der Häufigkeit von B-Zellen und der Monozyten-/Granulozytenfraktion erkennen lassen. Dabei wurde eine Zunahme der Häufigkeit von B-Zellen und der Monozyten/Granulozyten-Fraktion festgestellt. Dies führte zur Auslösung von Chemokinen und entzündlichen Zytokinen, einschließlich der Hochregulation von Genen, die an der Interferon-alpha (IFNα)- und -beta (INFβ)-Reaktion beteiligt sind. Dies legt eine verstärkte Immunantwort nahe und bestätigt den adjuvanten Effekt von RNA durch Modulation des angeborenen Immunsystems. Kapitel drei behandelt die Auswirkungen einer Autoantigen-kodierenden nicht-immunogenen RNA-LPX-Impfung bei experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE), einem Mausmodell für MS. Es wurde eine erfolgreiche Toleranzinduktion bei erkrankten EAE-Mäusen in Form hoher Effektor-Regulatorischer T-Zellen (Treg-Zellen) beobachtet, bei dem ein Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein-Peptid mit 1-Methylpseudouridin (MOG35_55_m1Ѱ) inkorporiert wurde. Die Hauptuntersuchung dieses Thesis-Kapitels zielte darauf ab, den Effekt von MOG35-55_U im Vergleich zu MOG35-55_m1Ѱ und irrelevantem m1Ψ zu analysieren und funktionelle Unterschiede hinsichtlich entzündlicher und immunsuppressiver Eigenschaften der vorliegenden CD4+ T-Zell-Subpopulationen zu untersuchen. Im Vergleich zu MOG35-55_m1Ѱ führte MOG35-55_U zu einer Herunterregulierung von Zellzyklus-Genen und resultierte in einer geringeren zytotoxischen Signatur, jedoch wurde ein höheres Stressniveau beobachtet. MOG35_55_U als ein immunogeneres mRNA-Konstrukt führte nicht zu einer Anreicherung von Signalwegen, die eine (stärkere) Toleranzinduktion bei erkrankten EAE-Mäusen zeigen. Schließlich wird in Kapitel 4 das therapeutische Potenzial von liposomal formulierter RNA, die für das modifizierte IL2var kodiert, allein oder in Kombination mit einem monoklonalen Antikörper gegen den programmierten Zelltod 1 (aPD1) in einem MC38-Tumormausmodell veranschaulicht, um die Immunantwort in CD45+-Zellen zu bewerten. Die Behandlung zeigte eine erhöhte Häufigkeit tumorinfiltrierender Lymphozyten (TILs), einen starken Effektorphänotyp, eine Reduktion von Erschöpfungsmarkern und eine gesteigerte Expression von Transkriptionsfaktoren, was auf ein vielversprechendes therapeutisches Potenzial eines Krebsimpfstoffs hinweist. Zusammenfassend ermöglichte die in dieser Arbeit entwickelte scRNA-seq-pipeline eine eingehende Analyse einzelner Zellsubsets auf Einzelzellebene und zeigte das Potenzial verschiedener RNA-basierter Behandlungen in Krebs- und Autoimmunkrankheitsmodellen auf. Weitere Forschung ist nötig, um die Fähigkeiten der Pipeline vollständig auszuschöpfen und therapeutische Strategien zu verbessern.