Understanding the molecular mechanisms of the T6SS in Photorhabdus luminescens and their potential for biotechnology

Abstract

Die Biotechnologie befasst sich mit der Nutzung biologischer Prozesse und Organismen für praktische Anwendungen, insbesondere zur Erforschung mikrobieller Systeme. Ziel ist es, deren Mechanismen detaillierter zu verstehen, um Fortschritte in der Medizin, Landwirtschaft und Industrie zu ermöglichen. Bakterielle Sekretionssysteme bergen ein beträchtliches Potenzial für die Biotechnologie, da sie als molekulare Waffen in Bakterien dienen, so beispielsweise das Typ VI-Sekretionssystem (T6SS). Das T6SS ermöglicht es Bakterien, toxische Effektoren zu sekretieren und somit Konkurrenzorganismen zu eliminieren, was essenziell für die Fitness und den Erfolg in komplexen Umgebungen ist. Trotz seiner zentralen Bedeutung sind viele Aspekte des T6SS, insbesondere in spezifischen Bakterienarten und dessen Beitrag zu mikrobiellen Interaktionen, noch weitgehend unbekannt. Die Untersuchung des T6SS in Photorhabdus luminescens, einem Insektenpathogen, das polymikrobielle Lebensräume wie Nematodendärme, Pflanzenwurzeln und Insektenlarven besiedelt, ist von besonderer Relevanz. Die Fähigkeit von P. luminescens, in derart unterschiedlichen Lebensräumen zu existieren, deutet auf komplexe Konkurrenzmechanismen hin, bei denen das T6SS vermutlich eine zentrale Rolle spielt. Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion des T6SS in P. luminescens zu analysieren, um dessen Bedeutung für bakterielle Konkurrenz, Fitness und Interaktionen innerhalb mikrobieller Gemeinschaften sowie mit Wirtsorganismen besser zu verstehen, sowie das Potenzial des T6SS für die biotechnologische Anwendung zu ermitteln. Mittels bioinformatischer Analysen konnten vier T6SS-Gencluster im Genom von P. luminescens DJC identifiziert werden, zusätzlich zu mehreren zusätzlichen Clustern, die für Effektor-Immunitäts-Paare kodieren. Diese Ergebnisse weisen auf das T6SS als entscheidenden Mechanismus hin, mit dem P. luminescens mit Konkurrenzorganismen interagiert. Proteomanalysen von Wildtyp- und T6SS-defizienten Stämmen zeigten signifikante Unterschiede in der Proteinexpression und verdeutlichten die Rolle des T6SS für die bakterielle Fitness. Insbesondere das T6SS-2 erwies sich als essenziell für die interbakterielle Konkurrenz und beeinflusste zugleich weitere Fitnessfaktoren wie die Motilität und den Sekundärstoffwechsel. T6SS-2-defiziente Stämme zeigten beispielsweise eine erhöhte Motilität und eine verstärkte Produktion von Anthrachinon, was darauf hindeutet, dass das T6SS nicht nur die bakterielle Konkurrenzfähigkeit, sondern auch andere essenzielle physiologische Prozesse beeinflusst. Darüber hinaus variierte die T6SS- Proteinkonzentration in Stämmen ohne T6SS-Funktion, was auf einen Kompensationsmechanismus hindeutet, da T6SS-1- und T6SS-2-defiziente Stämme höhere Proteinkonzentrationen von T6SS-3 und T6SS-4 aufwiesen. Insbesondere das T6SS-3 war aufgrund seiner neuartigen Struktur und Funktion, bei der verschiedene Kernkomponenten fehlen, besonders interessant. Es wurde festgestellt, dass das T6SS-3 an der interbakteriellen Konkurrenz beteiligt ist und für vier Lipase-Effektoren kodiert, darunter Tle4A, ein antibakterieller Effektor. Die einzigartige genetische Struktur des T6SS-3, die für mehrere VgrG-Tip-Proteine mit unterschiedlichen C-terminalen Domänen kodiert, ermöglicht vermutlich den Aufbau eines Multi-Effektorkomplexes. Dadurch kann das System einen Cocktail aus toxischen Effektoren in konkurrierende Zellen injizieren und so die Konkurrenzfähigkeit von P. luminescens in verschiedenen Lebensräumen verbessern. Fluorophore Reportermikroskopie zeigte eine hohe Expressionsrate von T6SS-3 unter verschiedenen Rhizosphären ähnlichen Umweltbedingungen, wie z. B. sauren, alkalischen und hohen Salzkonzentrationen. Darüber hinaus wurde die Expression bei 37°C beobachtet, was auf eine Rolle des T6SS-3 bei der Pathogenese von Insekten hinweist. Diese Anpassungsfähigkeit deutet darauf hin, dass das T6SS-3 eine entscheidende Rolle dabei spielt, dass das Bakterium in verschiedenen Umgebungen überleben kann. Darüber hinaus wurden zwei membranstörende Effektoren (Tme1) mit antibakterieller Aktivität identifiziert, die mit dem T6SS in Zusammenhang stehen. Diese Effektoren zerstören bakterielle Membranen, vermutlich durch Porenbildung und hemmen das bakterielle Zellwachstum. Mittels Zeitraffermikroskopie wurde gezeigt, dass Tme1A die Zellrundung, ein Kennzeichen der Porenbildung, induziert. Gleichzeitig neutralisieren die Tmi-Immunproteine (Tmi1A-F) diese toxischen Effektoren durch Bindung an die C-terminale Schleife der Tme-Effektorproteine. Um die Aktivität der Tme1-Effektoren zu ermitteln, wurden in P. luminescens durch Deletion des lux-Operons Lumineszenz-Reporter-Assays durchgeführt. So wurde ein neuer Ansatz zur Untersuchung von P. luminescens implementiert und außerdem konnte durch Reporterplasmide die Rolle von Tme1 gegen bakterielle Konkurrenten in vivo untersucht werden. Tatsächlich erwies sich Tme1A als aktiv gegen bakterielle Zellen und die Deletion von tme1A veränderte die Tötungsfähigkeit von P. luminescens. Folglich konnte die Rolle dieser Effektoren im interbakteriellen Wettbewerb eingeordnet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Forschungsarbeit das Verständnis der komplexen Rolle der T6SSs in P. luminescens vertieft und wichtige Funktion für die bakterielle Konkurrenz und Anpassung in verschiedenen Umgebungen aufzeigt. Diese Einblicke vertiefen nicht nur das Wissen über die interbakteriellen Interaktionen, sondern eröffnen auch Möglichkeiten für zukünftige biotechnologische Anwendungen, wie die Entwicklung bakterieller Systeme für gezielte antimikrobielle Strategien.

Biotechnology focuses on harnessing biological processes and organisms for practical applications, studying microbial systems to better understand their mechanisms and improving human health, agriculture, and industry. Bacterial secretion systems hold immense potential for the field, symbolising molecular weapons found in bacteria, like the type VI secretion system (T6SS). The T6SS facilitates competition by secreting toxic effectors to eliminate competitors thus being essential for bacterial fitness. Despite its significance, much remains unknown about how T6SSs act in different bacterial species and their contribution to microbial interactions. Investigating the T6SS in bacteria like Photorhabdus luminescens, which inhabits polymicrobial niches, is crucial to uncover bacterial strategies utilized to dominate and thrive in competitive environments. P. luminescens is an insect-pathogenic bacterium that colonizes various polymicrobial environments, such as nematode guts, plant roots and insect larvae. P. luminescens’ ability to inhabit these diverse niches suggests the employing of complex competitive mechanisms, possibly involving T6SSs. Nevertheless, the roles of T6SSs in P. luminescens remain poorly understood. Therefore, this study aims to investigate the T6SSs in P. luminescens to elucidate its role in bacterial competition and fitness, which could increase knowledge into microbial ecology and host-pathogen interactions. Initially, bioinformatic analyses identified four T6SS gene clusters in the P. luminescens DJC genome, alongside several auxiliary clusters encoding effector-immunity pairs, indicating T6SSs as a crucial mechanism to outcompete other organisms. Comparative proteome analysis between wild-type and T6SS-deficient strains revealed significant differences in protein abundance, demonstrating crucial role of T6SSs in enhancing the bacterial fitness. In particular, the T6SS-2 was found essential for interbacterial competition, underlining its role in microbial interactions. Further, the T6SSs were found linked to regulate other bacterial fitness factors, such as motility and secondary metabolism. Thus, strains lacking T6SS-2 showed increased movement and higher anthraquinone levels, suggesting that T6SSs not only impact bacterial competition but also influences other virulent key aspects found in P. luminescens. Additionally, T6SS protein abundance varied in strains lacking T6SS function, indicating a compensatory mechanism. The T6SS-3 was particularly intriguing due to its novel structure and function, lacking diverse core components. However, the T6SS-3 was found involved in interbacterial competition, encoding four lipase effectors: including Tle4A, an antibacterial effector. The unique genetic structure of T6SS-3, encoding multiple VgrG tip-proteins with different C-terminal domains, likely facilitates the assembly of a multi-effector complex. This allows the system to inject a cocktail of toxic effectors into competitor cells, enhancing P. luminescens’ ability to compete in diverse environments. Fluorophore reporter microscopy showed a high expression rate of the T6SS-3 under various rhizosphere-similar environmental conditions, such as acidic, alkaline, and high salt concentrations. Moreover, expression was observed at 37°C, indicating a role in insect pathogenesis. This adaptability suggests a critical role of the T6SS-3 in enabling the bacterium to thrive in different environments. Furthermore, two membrane-disrupting effectors (Tme1) with antibacterial activity and related to the T6SS were identified. These effectors disrupt bacterial membranes putatively through pore formation and reduce bacterial cell growth. Time-lapse microscopy confirmed that Tme1A induces cell rounding, a hallmark of pore formation. Moreover, the Tmi immunity proteins (Tmi1A-F) neutralize these toxic effectors throughout binding on its C-terminal loop. Further, to assess the activity of the Tme1 effectors, luminescence-based reporter assays were established in P. luminescens through deletion of the lux operon. Thus, a new approach to study P. luminescens was implemented and further, reporter plasmids were used to monitor the role of Tme1 against bacterial competitors in vivo. Indeed, Tme1A was found active against bacterial cells and deletion of tme1A altered the killing capacity of P. luminescens. Thus, a role of those effectors in interbacterial competition could be assigned. In summary, this research advances our understanding of the complex role of T6SSs in P. luminescens, revealing their critical functions in bacterial competition and adaptation across diverse environments. These insights not only deepen our knowledge of interspecies interactions but also open avenues for future biotechnological applications, such as engineering bacterial systems for targeted antimicrobial strategies or sustainable agricultural.