DNA condensates with embedded structures, functions, and reaction networks

Abstract

DNA nanotechnology has traditionally relied on the precise Watson–Crick–Franklin base-pairing interaction for programming synthetic DNA oligonucleotides to construct well-defined nanostructure and nanodevices. The development of toehold-mediated strand displacement reactions further expanded the field into DNA reaction networks for applications in detection, diagnostics, and computation. Nevertheless, DNA nanotechnology faces a challenge in scaling to larger materials and systems. Recently, synthetic long-chain single-stranded DNA polymers have been shown to undergo temperature-induced phase separation, yielding micron-sized DNA condensates that extend the scope of DNA-based materials and open possibilities for new applications. These condensates closely resemble biomolecular condensates found in cells, formed through liquid–liquid phase separation of proteins and nucleic acids. They provide valuable model systems for studying the properties and mechanisms of biomolecular condensates in controlled settings. Meanwhile, their inherent compatibility with DNA nanotechnology and synthetic biology make DNA condensates promising synthetic cell models for integrating structures and functions. Finally, DNA condensates introduce a new hierarchical level of DNA-based materials for constructing complex multiscale architectures and provide a versatile compartmentalization strategy for DNA reaction networks to address challenges in scalability and modularity. At the intersection of soft matter, supramolecular chemistry, DNA nanotechnology, and synthetic biology, this thesis explores the application of DNA condensates across different research topics: In the first part of the thesis, DNA condensates are investigated as a model system for biomolecular condensates. They reveal how macromolecular transport within condensates can deviate from classical Fickian diffusion under certain conditions. This study identifies a new transport mechanism, termed ballistic wave diffusion. It emerges from molecular-recognition-mediated transition of condensates from arrested to dynamic states. This mechanism offers a new perspective on macromolecular transport within biomolecular condensates, providing fundamental insights into their behavior in cellular environments. Beyond serving as model systems for biomolecular condensates, DNA condensates also provide a versatile platform for constructing minimalistic synthetic cells. In the second part of this thesis, they are used to incorporate subcellular structures and transcription function. A co-phase-separation strategy is developed for functionalizing their core with unique single-stranded DNA sequences as recognition barcodes for binding complementary strands. These barcodes enable them to modularly integrate DNA tiles at defined concentrations, enabling the controlled formation of DNA nanotubes inside synthetic cells as artificial cytoskeletons. These cytoskeletons enhance the mechanical stability of synthetic cells and support the formation of a stable synthetic cell-cell interface via cRGD-integrin binding. In parallel, co-phase separation has been leveraged to introduce transcription promoter sequences into DNA condensates, enabling the sequestration of transcription templates and enzymes. This endows the condensates with the ability to locally transcribe RNA nanostar sequences in their cores, which subsequently condense into diverse artificial condensate patterns as intracellular compartments. This thesis also explores the application of DNA condensates as a compartmentalization strategy for DNA reaction networks. DNA barcodes inside DNA condensates are used to compartmentalize DNA reaction components. In contrast to the global diffusion and reaction observed in solution-based systems, confining DNA reactions within condensates physically isolates sequences from different networks, thereby preventing unwanted diffusion and crosstalk. This allows multiple reaction networks to be independently executed in a single system. Moreover, this approach simplifies design principles and allows the reuse of identical sequence designs for different reactions without interference, facilitating improved scalability and modularity in DNA reaction networks. From a future perspective, the concepts and approaches developed in this thesis open up opportunities across various research directions. DNA condensates and ballistic wave diffusion could be harnessed to design a gating mechanism that controls the transport of large macromolecules through size-exclusion effects, representing responsive material systems. Their core barcodes could be engineered to integrate multiple functional modules and enable synergistic effects in advanced synthetic cell systems. In addition, DNA condensates can enrich dilute species through barcode recognition and facilitate localized reactions via proximity effects, with potential applications in detection and diagnostics. Of particular interest, DNA condensates may be further developed for compartmentalizing complex DNA reaction networks, such as multi-bit DNA Adder gate arrays, thereby enabling more sophisticated and scalable DNA computing systems capable of addressing challenging tasks.

Die DNA-Nanotechnologie stützte sich traditionell auf die präzise Watson-Crick-Franklin-Basenpaarungsinteraktion, um synthetische DNA-Oligonukleotide für den Aufbau genau definierter Nanostrukturen und Nanobauelemente zu programmieren. Die Entwicklung von „toehold-vermittelten“ Strangverdrängungsreaktionen erweiterte das Feld hin zu DNA-Reaktionsnetzwerken für Anwendungen in der Detektion, Diagnostik und im Computing. Dennoch steht die DNA-Nanotechnologie vor der Herausforderung, auf größere Materialien und Systeme zu skalieren. Kürzlich wurde gezeigt, dass synthetische langkettige einzelsträngige DNA-Polymere eine temperaturinduzierte Phasentrennung durchlaufen, was zu mikrometergroßen DNA-Kondensaten führt, die den Anwendungsbereich von DNA-basierten Materialien erweitern und Möglichkeiten für neue Anwendungen eröffnen. Diese Kondensate ähneln stark den in Zellen vorkommenden biomolekularen Kondensaten, die durch Flüssig-Flüssig-Phasentrennung von Proteinen und Nukleinsäuren gebildet werden. Sie stellen wertvolle Modellsysteme dar, um die Eigenschaften und Mechanismen von biomolekularen Kondensaten unter kontrollierten Bedingungen zu untersuchen. Gleichzeitig macht ihre inhärente Kompatibilität mit der DNA-Nanotechnologie und der synthetischen Biologie DNA-Kondensate zu vielversprechenden synthetischen Zellmodellen für die Integration von Strukturen und Funktionen. Schließlich führen DNA-Kondensate eine neue hierarchische Ebene von DNA-basierten Materialien für den Aufbau komplexer, mehrskaliger Architekturen ein und bieten eine vielseitige Kompartimentierungsstrategie für DNA-Reaktionsnetzwerke, um Herausforderungen in der Skalierbarkeit und Modularität zu bewältigen. An der Schnittstelle von weicher Materie, supramolekularer Chemie, DNA-Nanotechnologie und synthetischer Biologie untersucht diese Dissertation die Anwendung von DNA-Kondensaten in verschiedenen Forschungsthemen: Im ersten Teil der Arbeit werden DNA-Kondensate als Modellsystem für biomolekulare Kondensate untersucht. Sie zeigen auf, wie der makromolekulare Transport innerhalb von Kondensaten unter bestimmten Bedingungen von der klassischen Fickschen Diffusion abweichen kann. Diese Studie identifiziert einen neuen Transportmechanismus, der als ballistische Wellendiffusion (ballsitic wave diffusion) bezeichnet wird. Er entsteht durch einen molekular-erkennungs-vermittelten Übergang von Kondensaten von einem arretierten in einen dynamischen Zustand. Dieser Mechanismus bietet eine neue Perspektive auf den makromolekularen Transport innerhalb biomolekularer Kondensate und liefert grundlegende Einblicke in ihr Verhalten in zellulären Umgebungen. Über ihre Funktion als Modellsysteme für biomolekulare Kondensate hinaus bieten DNA-Kondensate auch eine vielseitige Plattform für den Aufbau minimalistischer synthetischer Zellen. Im zweiten Teil dieser Arbeit werden sie genutzt, um subzelluläre Strukturen und Transkriptionsfunktionen zu integrieren. Es wird eine Ko-Phasentrennungsstrategie entwickelt, um ihren Kern mit einzigartigen einzelsträngigen DNA-Sequenzen als Erkennungs-Barcodes für die Bindung komplementärer Stränge zu funktionalisieren. Diese Barcodes ermöglichen die modulare Integration von DNA-Kacheln (DNA tiles) in definierten Konzentrationen, was die kontrollierte Bildung von DNA-Nanoröhrchen (DNA nanotubes) im Inneren synthetischer Zellen als künstliche Zytoskelette erlaubt. Diese Zytoskelette erhöhen die mechanische Stabilität der synthetischen Zellen und unterstützen die Bildung einer stabilen synthetischen Zell-Zell-Schnittstelle über cRGD-Integrin-Bindung. Parallel dazu wurde die Ko-Phasentrennung genutzt, um Transkriptions-Promotor-Sequenzen in DNA-Kondensate einzuführen, was die Sequestrierung von Transkriptionsvorlagen und Enzymen ermöglicht. Dies verleiht den Kondensaten die Fähigkeit, in ihren Kernen lokal RNA-Nanostern-Sequenzen zu transkribieren, die anschließend zu vielfältigen künstlichen Kondensatmustern als intrazelluläre Kompartimente kondensieren. Diese Arbeit untersucht auch die Anwendung von DNA-Kondensaten als Kompartimentierungsstrategie für DNA-Reaktionsnetzwerke. DNA-Barcodes im Inneren von DNA-Kondensaten werden verwendet, um Komponenten von DNA-Reaktionen zu kompartimentieren. Im Gegensatz zur globalen Diffusion und Reaktion, die in lösungsbasierten Systemen beobachtet wird, isoliert die Beschränkung von DNA-Reaktionen innerhalb von Kondensaten Sequenzen aus verschiedenen Netzwerken physisch und verhindert so unerwünschte Diffusion und Übersprechen (Crosstalk). Dies ermöglicht die unabhängige Ausführung mehrerer Reaktionsnetzwerke in einem einzigen System. Darüber hinaus vereinfacht dieser Ansatz die Designprinzipien und erlaubt die Wiederverwendung identischer Sequenzdesigns für verschiedene Reaktionen ohne Interferenzen, was eine verbesserte Skalierbarkeit und Modularität in DNA-Reaktionsnetzwerken ermöglicht. Aus zukünftiger Perspektive eröffnen die in dieser Arbeit entwickelten Konzepte und Ansätze Möglichkeiten für verschiedene Forschungsrichtungen. DNA-Kondensate und die ballistische Wellendiffusion könnten genutzt werden, um einen Gating-Mechanismus zu entwerfen, der den Transport großer Makromoleküle durch Größenausschluss-Effekte steuert und so responsive Materialsysteme darstellt. Ihre Kern-Barcodes könnten so konstruiert werden, dass sie mehrere funktionelle Module integrieren und synergistische Effekte in fortschrittlichen synthetischen Zellsystemen ermöglichen. Zusätzlich können DNA-Kondensate verdünnte Spezies durch Barcode-Erkennung anreichern und lokalisierte Reaktionen über Proximity-Effekte erleichtern, mit potenziellen Anwendungen in der Detektion und Diagnostik. Von besonderem Interesse ist die Weiterentwicklung von DNA-Kondensaten zur Kompartimentierung komplexer DNA-Reaktionsnetzwerke, wie zum Beispiel Multi-Bit-DNA-Addiergatter-Arrays, um dadurch anspruchsvollere und skalierbarere DNA-Computingsysteme zu ermöglichen, die in der Lage sind, herausfordernde Aufgaben zu bewältigen.