Exploration of covalent inhibitors for trypsin-like serine proteases
Loading...
Date issued
Authors
Editors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Reuse License
Abstract
Eliminating past concerns about toxicity issues, covalent inhibitors have successfully overcome their bad reputation and ushered a new era in the development of protease inhibitors. This resulted in the approval of several drugs by the U.S. Food and Drug Administration. A peptidomimetic recognition sequence, combined with an electrophilic moiety (warhead), which is responsible for the covalent bond to the target enzyme, has been recognized as an effective inhibitor scaffold. The present dissertation is about the investigation and characterization of covalent peptidomimetic protease inhibitors, regarding their pharmacodynamic properties and improvement of the associated fluorometric inhibition assay (chapter A) as well as the evaluation of covalent inhibitors for trypsin-like serine proteases (chapter B). Kovalente Inhibitoren konnten ihren schlechten Ruf bezüglich früherer Toxizitätsbedenken überwinden und läuteten eine neue Ära der Entwicklung von Proteaseinhibitoren ein, welche zu mehreren Arzneimittelzulassungen der U.S. Food and Drug Administration führte. Dabei kristallisierte sich eine peptidomimetische Erkennungssequenz, gepaart mit einer geeigneten elektrophilen Kopfgruppe (Warhead) als effektives Grundgerüst für die Entwicklung von Inhibitoren heraus. Die vorliegende Dissertation handelt von der Untersuchung kovalenter Proteaseinhibitoren bezüglich ihrer pharmakodynamischen Eigenschaften sowie Optimierung des fluoreszenzbasierten Inhibitionsassays (Kapitel A), und präsentiert das rationale Design kovalenter Inhibitoren gegenüber Trypsin-ähnlichen Serinproteasen (Kapitel B).
Kapitel A: Zur Vermeidung potenzieller Nebenwirkungen, verursacht durch unspezifische Bindung an physiologische Nukleophile und andere Enzyme, ist es von größter Wichtigkeit, die richtige Wahl des kovalenten Warheads und der peptidomimetischen Erkennungssequenz im Rahmen der Inhibitor-Entwicklung zu treffen. Das erste Projekt umfasst die Synthese kovalenter Inhibitoren mit Kombinationen verschiedener peptidomimetischer Grundgerüste und Warheads sowie die Charakterisierung ihrer Inhibition durch Fluoreszenzassays gegenüber unterschiedlichen Proteasen. Zusätzlich wurden NMR- und LC-MS-basierte Reaktivitätstestungen mit den ausgewählten Warheads gegenüber Modell-Nukleophilen der Serin-/Threonin- und Cysteinproteasen durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse beider Testsysteme wurden mit quantenmechanischen und computergestützten Bindungsexperimenten untermauert.
Häufig verwendete Fluoreszenzsubstrate des oben erwähnten Inhibitionsassays besitzen Anregungs- und Emissionwellenlängen der jeweiligen freien Fluorophore im kurzwelligen Bereich. Dadurch besteht die Gefahr von typischen Assay-Interferenzen, welche zu falsch-positiven und -negativen Ergebnissen führen können. Aufgrund dessen wurden durch Nutzung von 7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-amin (NBD) als Fluorophor Anregungs- und Emissionswellenlängen in den höheren Wellenlängenbereich verschoben, sodass typische Assay-Interferenzen vermieden und verlässliche Inhibitionsergebnisse erhalten werden können.
Kapitel B: Trypsin-ähnliche Serinproteasen stellen einen wichtigen Bestandteil von vielen physiologischen Prozessen wie der Blutgerinnung und der Umstrukturierung der extrazellulären Matrix dar, können jedoch bei Deregulierung pathologische Ereignisse fördern. Die Enzyme Urokinase-Typ Plasminogen-Aktivator (uPA) und Hepsin können beide bei Überexpression die Tumorprogression, -proliferation und -metastasierung unterstützen. Ein weiteres Beispiel stellt die Transmembran- Serinprotease 2 (TMPRSS2) dar, welche den viralen Zelleintritt von Coronaviren ermöglicht und erneut durch die SARS-CoV-2 Pandemie in den Fokus geriet. Kapitel B beschreibt das rationale Design von peptidomimetischen kovalenten Inhibitoren gegenüber den drei genannten Serinproteasen.