Orchestrating transposon regulation in the male germline – the role of DNA methylation, histone marks and transcription factors

Abstract

Transposable elements (TEs) are mobile DNA sequences, which can proliferate and change their position in the genome. They are part of all eukaryotic genomes and make up a significant portion of mammalian genomes. While they drive evolutionary innovation, their ability to replicate poses a major threat to genome stability. In somatic tissues, transposons are effectively silenced by DNA methylation. However, during mammalian development, DNA methylation is dynamic and undergoes reprogramming. The germline reprogramming wave erases somatic methylation patterns, allowing the activation of germline genes that are essential for development. However, this also creates a window of opportunity for TEs to become active. In male germ cells, this is counteracted by the piRNA pathway, which processes TE-derived mRNA into piRNAs that guide de novo DNA methylation to the promoters of young, active TEs. This process is mediated by the male rodent-specific methyltransferase DNMT3C and its cofactor DNMT3L. The piRNA pathway and TEs are engaged in a continuous evolutionary arms race: while the silencing machinery evolves to suppress newly active TEs, TEs must evade this suppression to proliferate. Failure of the silencing machinery leads to TE upregulation, resulting in defective chromosome pairing, meiotic arrest, and ultimately male sterility. Notably, these spermatogenic defects arise several days after the failure of de novo methylation in fetal germ cells, suggesting that additional regulatory mechanisms govern TEs in the absence of DNA methylation. To investigate TE regulation in the absence of DNA methylation, we first analyzed TE expression in Dnmt3CKO/KO mutants across sorted germ cell stages. Contrary to previous reports, we found that the young, active TEs, LINE1s and IAPs, become already active before meiosis in the absence of DNA methylation, while LINE1 expression further increases at meiosis. Next, we examined histone modifications associated with TE regulation in the absence of DNA methylation, revealing dynamic chromatin signatures during spermatogenesis. Specifically, we identified bivalent chromatin marks at unmethylated TE promoters: H3K4me3-H3K9me3 at LINE1 elements in fetal germ cells before DNMT3C-mediated methylation, and H3K4me3-H3K27me3 at TEs before meiosis in Dnmt3CKO/KO mutants. The bivalent H3K4me3-H3K27me3 mark may poise TE expression before meiosis while protecting them from DNA methylation. At the onset of meiosis, this mark transitioned to a more open chromatin state, correlating with high TE expression when DNA methylation is not in place. To further explore TE regulation, we conducted an unbiased proteomic pulldown screen to identify factors binding TE promoters in a DNA methylation-dependent manner. Among other interesting candidates, we found NRF1, a DNA methylation-sensitive transcription factor, known to regulate germline genes, to specifically bind unmethylated TE promoters in male germ cells. To characterize NRF1 and other factors binding at TEs, we explored and optimized low-input chromatin profiling methods. This expertise enabled collaborations with other laboratories, where we demonstrated that the chromatin reader SPIN1 binds the bivalent H3K4me3-H3K9me3 signature at LINE1 elements in fetal germ cells, facilitating SPOCD1 recruitment and DNMT3C-mediated silencing. Furthermore, we showed that NRF1 binds LINE1s and IAPs in postnatal germ cells when DNA methylation is absent at their promoters, with increased binding at meiosis. Finally, we tested a causative correlation, using a conditional NRF1 knockout in Dnmt3CKO/KO mice, and demonstrated that NRF1 activates unmethylated IAP elements before meiosis, while our data suggest a potential additional role in LINE1 regulation at meiosis. Overall, we show that a bivalent chromatin signature and NRF1 as a DNA methylation-sensitive transcription factor orchestrate TE regulation in male germ cells when DNA methylation is absent at TE promoters. Our findings shed light on how TEs expand in genomes threatening germline genomic integrity and provide broader insights into how epigenetic mechanisms and transcription factors interact to regulate gene expression.

Transposons sind mobile DNA-Sequenzen, die in allen eukaryotischen Genomen vorkommen und einen erheblichen Anteil der Säugetiergenome ausmachen. Während sie die evolutionäre Innovation vorantreiben, stellt ihre Fähigkeit zur Replikation eine ernsthafte Bedrohung für die genomische Stabilität dar. In somatischen Geweben werden Transposons effektiv durch DNA-Methylierung stillgelegt. Während der Entwicklung von Säugetieren ist die DNA-Methylierung jedoch dynamisch und durchläuft eine Reprogrammierung. Eine Reprogrammierungswelle in der Keimbahnentwicklung löscht die somatischen Methylierungsmuster, was die Aktivierung von Keimbahn-spezifischen Genen ermöglicht, die für die Entwicklung essenziell sind. Gleichzeitig öffnet sich dadurch jedoch ein mögliches Zeitfenster, für Transposons aktiv zu werden. In männlichen Keimzellen wird dies durch den piRNA Pathway entgegengewirkt. Hierbei werden transposon-abgeleitete mRNAs in piRNAs verarbeitet, die die de novo DNA-Methylierung an den Promotoren junger, aktiver Transposons steuern. Dieser Prozess wird durch die männlich-spezifische Methyltransferase DNMT3C und ihren Kofaktor DNMT3L vermittelt. Zwischen dem piRNA Pathway und den Transposons besteht ein evolutionäres Wettrüsten: Während die Stilllegungs-Maschinerie ständig weiterentwickelt wird, um neu aktive Tranpsosons zu erkennen und zu unterdrücken, müssen sich Transposons dieser Kontrolle entziehen, um sich zu vermehren. Ein Versagen des piRNA Pathways führt zu einer Hochregulierung von Transposons, was zu fehlerhafter Chromosomenpaarung, meiotischem Arrest und schließlich männlicher Sterilität führt. Interessanterweise treten diese Spermatogenesedefekte erst mehrere Tage nach dem Fehlschlagen der de novo Methylierung in fetalen Keimzellen auf, was darauf hindeutet, dass zusätzliche Regulationsmechanismen Transposons in Abwesenheit von DNA-Methylierung kontrollieren. Um die Regulation von Transposons in Abwesenheit von DNA-Methylierung zu untersuchen, analysierten wir zunächst die Transposon-Expression in Dnmt3CKO/KO Mutanten über sortierte Keimzellstadien hinweg. Entgegen früherer Berichte fanden wir, dass die jungen, aktiven Tranposons LINE1s und IAPs bereits vor der Meiose aktiv sind, wenn DNA-Methylierung fehlt und die LINE1-Expression in der Meiose weiter ansteigt. Anschließend untersuchten wir die mit der Transposon-Regulation assoziierten Histonmodifikationen und stellten dynamische Histonmodifikations-Signaturen an Transposons in Abwesenheit von DNA-Methylierung während der Spermatogenese fest. Insbesondere identifizierten wir bivalente Histonmodifikationen: H3K4me3-H3K9me3 an LINE1-Elementen in fetalen Keimzellen vor der piRNA-vermittelten DNA Methylierung und H3K4me3-H3K27me3 an Transposons vor der Meiose in Dnmt3CKO/KO Mutanten. Die bivalente H3K4me3-H3K27me3 Markierung könnte die Transposon-Expression bevor der Meiose in einem zur Expression-bereitem Zustand halten und gleichzeitig vor DNA-Methylierung schützen. Zu Beginn der Meiose ging diese Markierung in einen offeneren Chromatinzustand über, was mit einer starken Transposon-Expression in der Abwesenheit von DNA-Methylierung korrelierte. Um die Transposon-Regulation weiter zu erforschen, führten wir einen unvoreingenommenen proteomischen Pulldown-Screen durch, um Faktoren zu identifizieren, die Transposon-Promotoren in einem DNA-Methylierungs-abhängigen Kontext binden. Dabei identifizierten wir NRF1, einen DNA-methylierungssensitiven Transkriptionsfaktor, der für die Regulation von Keimbahn-Genen bekannt ist, als spezifischen Binder von unmethylierten Transposon-Promotoren in männlichen Keimzellen. Um NRF1 und andere an Transposon-bindende Faktoren zu charakterisieren, optimierten wir Chromatin-Profiling-Methoden in niedrigem Input. Diese Expertise ermöglichte uns Kooperationen mit anderen Laboren, in denen wir zeigten, dass der Chromatinleser SPIN1 die H3K4me3-H3K9me3-Signatur an LINE1-Elementen in fetalen Keimzellen erkennt und damit die SPOCD1-Rekrutierung sowie die piRNA-Weg-vermittelte Stilllegung von Transposons unterstützt. Zudem konnten wir zeigen, dass NRF1 in postnatalen Keimzellen an unmethylierte LINE1- und IAP-Elemente bindet, und die Bindung in der Meiose verstärkt ist. Schließlich konnten wir mit einem konditionalen NRF1-Knockout in Dnmt3CKO/KO Mäusen nachweisen, dass NRF1 unmethylierte IAP-Elemente vor der Meiose aktiviert, während unsere Daten auf eine mögliche zusätzliche Rolle bei der LINE1-Regulation in der Meiose hindeuten. Insgesamt zeigen wir, dass eine bivalente Chromatin-Signatur sowie NRF1 als ein DNA-methylierungssensitiver Transkriptionsfaktor die Transposon-Regulation in männlichen Keimzellen dirigieren, wenn DNA-Methylierung an ihren Promotoren fehlt. Unsere Erkenntnisse liefern neue Einblicke, wie Tranposons sich in Genomen ausbreiten mit Implikationen auf Keimzell-genomische Instabilität, und tragen zu einem besseren Verständnis der Interaktion zwischen epigenetischen Mechanismen und Transkriptionsfaktoren in der Genregulation bei.