Rekonstitution des Fumaratsensors DcuS in Liposomen und Transport von Fumarat und Succinat in Escherichia coli

Abstract

Das Zweikomponentenregulationssystem DcuSR kontrolliert die Expression der wichtigsten fumaratinduzierten Gene in Escherichia coli. Die Gene dcuB und dctA, die fürDicarboxylatcarrier kodieren, sowie das Fumaratreduktase-Operon (frd), sind Zielgene für DcuSR. DcuS ist eine membranständige Sensorkinase mit einer großen periplasmatischen Domäne. NMR-spektroskopische Untersuchungen dieser Domäne zeigen Alpha-Helices und Beta-Faltblätter. Für die Fumaratbindung wichtige Aminosäuren wurden durch Mutagenese identifiziert. Gereinigtes DcuS wurde in Liposomen rekonstituiert. In Anwesenheit von ATP wird DcuS autophosphoryliert. Der Phosphatrest kann dann auf DcuR übertragen werden und beweist somit die Aktivität dieses in vitro Testsystems.Der Transport von C4-Dicarboxylaten erfolgt unter anaeroben Bedingungen durch die sekundären Carrier DcuA, DcuB und DcuC. Es konnte ein weiteres Protein (DcuD) identifiziert werden, das hohe Sequenzähnlichkeit zu DcuC aufweist. Eine dcuD-Mutante zeigte keinen Phänotyp und überproduziertes DcuD konnte den Ausfall der anderen Dcu-Carrier nicht kompensieren. DcuD ist damit ein kryptisches Mitglied der Dcu-Carrierfamilie. Unter aeroben Bedingungen katalysiert DctA den Transport von C4-Dicarboxylaten. Dennoch können dctA-Mutanten noch mit Succinat wachsen. Die Diffusionsrate von Succinat durch Membranen wurde bestimmt. Sie ist um Größenordnungen niedriger als der Transport in der Mutante. Bei dem DctA unabhängigen Transportsystem handelt es sich um einen H+/Succinat2-Symporter, der bei saurem pH aktiv ist und viele Eigenschaften eines Monocarboxylatcarriers aufweist.

The two-component-system DcuSR controls expression of fumarate induced genes in Escherichia coli. The genes dcuA and dctA encoding dicarboxylate-carriers and the fumarate reductase operon (frd) are target genes for DcuSR.NMR-spectroscopy revealed that the periplasmatic domain of the membrane located sensorkinase DcuS consists of alpha-helices and beta-sheets. Amino acids, important for fumarate binding were identified by mutageneses. Purified DcuS was reconstituted in liposomes. In the presence of ATP DcuS can be autophosphorylated. The phosphate residue can be transferred to DcuR, demonstrating the active state of this in vitro system.Under anaerobic conditions, the transport of C4-dicarboxylates is mediated by the secondary carriers DcuA, DcuB and DcuC. A further protein (DcuD) was identified which shows high sequence similarity to DcuC. However, the dcuD-mutant showed no phenotype and overexpressed DcuD could not compensate the function of Dcu-carriers in dcu-mutants. Therefore, DcuD is a cryptic member of the Dcu-carrier-family.Under aerobic conditions, DctA catalyzes the transport of C4-dicarboxylates but dctA-mutants can still grow with succinate. The diffusion rate for succinate through the membrane was lower than the transport rate in the mutant by several orders of magnitude. This DctA independent transport-system is a H+/succinate2-symporter, active at low pH having properties of monocarboxylate carriers.