Targeting Leishmania: exploring novel antileishmanial compounds and drug targets in the context of parasite cell death

Abstract

Leishmaniasis is a neglected tropical disease with limited therapeutic options. This thesis employed two complementary approaches and human primary cell models to identify novel biological concepts which may contribute to therapeutic advancements. In a series of phenotypic screenings, pateamines and arylmethylaminosteroids were identified as chemical entities eliciting in vitro antileishmanial effects. While pateamines exhibited excessive cytotoxicity towards host macrophages, both arylmethylaminosteroids could significantly reduce intracellular parasite burden. Based on their activity, authorized compounds fulfilling pharmacophore criteria were tested for antileishmanial activity with an extraordinary hit rate. Repurposing of established drugs is a pragmatic strategy to accelerate the development of new antiparasitic therapies. As a second approach, putative drug targets in Leishmania major linked to cell death were investigated. Many cellular processes in these parasites remain poorly characterized. Programmed cell death is a potential drug target, as not only regulates parasite survival and death but also facilitates immunosuppressive mechanisms. Genome editing was employed to delete candidate genes hypothesized to be associated with this process. However, no links to cell death pathways were discovered. Instead, a quantitative proteomics study identified p1/s1, a 3’-nucleotidase/nuclease, as enriched in sub-lethal stress and potentially involved in DNA degradation. Extensive characterization of this versatile ecto-enzyme revealed no link to cell death, but its dual activity was confirmed in an inducible knockout system. Degradation of free 3’-nucleotides and nucleic acids by p1/s1 provides L. major with essential purines while simultaneously facilitating immune evasion. Specifically, during in vitro infection, 3’-AMP hydrolysis led to decreased pro-inflammatory TNFα secretion and reduced T cell proliferation via the generation of immunomodulatory adenosine. Furthermore, p1/s1-mediated endonuclease activity enabled L. major to degrade and escape neutrophil extracellular traps. In summary, this thesis provides new insights into the molecular biology of Leishmania and outlines several novel antileishmanial strategies, highlighting potential directions for the development of future therapeutics.

Leishmaniose ist eine vernachlässigte Tropenkrankheit mit begrenzten therapeutischen Möglichkeiten. Diese Dissertation nutzt zwei komplementäre Herangehensweisen und humane Primärzellmodelle, um neue biologische Konzepte zu identifizieren, die zu therapeutischen Fortschritten beitragen können. In phänotypischen Testungen wurden Pateamine und Arylmethylaminosteroide als Substanzklassen identifiziert, die in vitro antileishmaniale Effekte hervorrufen. Wohingegen Pateamine übermäßige Zytotoxizität auf Makrophagen zeigten, konnten beide Arylmethylaminosteroide die intrazelluläre Parasitenlast signifikant reduzieren. Basierend auf deren Aktivität wurden bereits zugelassene Wirkstoffe, die Pharmakophor-Kriterien erfüllen, mit außergewöhnlich hoher Trefferquote auf antileishmaniale Aktivität getestet. Die Umwidmung von etablierten Medikamenten stellt einen pragmatischen Ansatz dar, um die Entwicklung neuer antiparasitärer Therapien zu beschleunigen. Als zweiter Ansatz wurden mutmaßliche Wirkstoff-Zielproteine in Leishmania major untersucht, die in Verbindung mit Zelltod stehen könnten. Viele zelluläre Prozesse dieser Parasiten sind nur unzureichend charakterisiert. Programmierter Zelltod in Leishmanien ist ein potenzielles Ziel für Wirkstoffe, da er Überleben und Tod der Parasiten steuert, aber auch immunsuppressive Mechanismen ermöglicht. Mittels Genom- Editierung wurden Kandidatengene deletiert, die in Verbindung mit diesem Prozess stehen könnten. Allerdings wurden keine direkten Verbindungen zu Zelltod gezeigt. Stattdessen identifizierte eine quantitative Proteomstudie die 3’-Nukleotidase/Nuklease p1/s1, die unter subletalem Stress an DNA Abbau beteiligt sein könnte. Eine umfangreiche Charakterisierung dieses vielseitige Ektoenzyms zeigte keine Verbindung zu Zelltod auf. Dagegen wurde dessen duale Aktivität durch eine induzierte Gendeletion bestätigt. Der Abbau von freien 3’-Nukleotiden und Nukleinsäuren durch p1/s1 versorgt L. major mit essentiellen Purinen, ermöglicht aber auch Mechanismen der Immunevasion. Insbesondere führte die Hydrolyse von 3’-AMP während in vitro Infektionen durch Generierung von immunmodulatorischem Adenosin zu verminderter Sekretion von proinflammatorischem TNFα und T-Zell Proliferation. Weiterhin erlaubte die p1/s1-induzierte Endonuklease-Aktivität den Abbau von Neutrophilen Extrazellulären Fallen und damit den Austritt aus solchen. Zusammengefasst bietet diese Thesis neue Erkenntnisse in der Molekularbiologie von Leishmanien und beschreibt mehrere neuartige antileishmaniale Strategien, die potenzielle Ansätze für die Entwicklung zukünftiger Therapien aufzeigen.