Characterization of DNMT3C-mediated inactivation of active transposons in mouse
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Transponierbare Elemente (TEs) sind parasitäre Sequenzen im Genom. Argonaute PIWI-Proteine und die mit ihnen verbundenen Piwi-interagierenden RNAs (piRNAs) sind für die DNA-Methylierung-abhängige Inaktivierung von transponierbaren Elementen (TEs) in embryonalen Keimzellen der Maus erforderlich. Unklar ist jedoch, wie die DNA-Methylierung in den Kontext eines aktiven Promotors gebracht wird und welche DNA-Methylierungsmaschinerie daran beteiligt ist. Bei Mäusen hat sich eine keimlinienspezifische de novo-DNA-Methyltransferase, DNMT3C, entwickelt, deren Aktivität für die TE-Promotor-Methylierung wesentlich ist. Um die Mechanismen des DNMT3C-Targetings zu untersuchen, haben wir eine transgene Mauslinie mit einem endogen markierten DNMT3C-Allel erzeugt. Mit Hilfe dieser transgenen Linie konnten wir die Proteininteraktoren von DNMT3C in männlichen embryonalen Keimzellen der Maus durch Immunpräzipitation und Massenspektrometrie aufdecken. Unter den aufgedeckten Proteinen, die im DNMT3C-Interaktom angereichert sind, fanden wir Mitglieder des zentralen nuklearen piRNA-Wegs und verwandte Proteine, einschließlich MIWI2, SPOCD1, TEX15 und SPIN1, signifikant angereichert. Wir validierten diese Verbindung zum nukleären piRNA-Signalweg durch Immunpräzipitation, gefolgt von Western Blotting und nukleärer Kolokalisierung in embryonalen Keimzellen. Die genomweiten Ziele von DNMT3C, MIWI2 und SPOCD1 in männlichen Keimzellen sind nahezu identisch. Unsere Daten zeigen, dass DNMT3C durch den piRNA-Weg auf TE-Promotoren ausgerichtet ist.
Während der Keimbahnentwicklung der Maus werden junge und aktive TE-Promotoren transkriptionell aktiv und gewinnen H3K4me3. H3K4me3 ist eine Modifikation, die an aktiven Promotoren vorkommt und dafür bekannt ist, de novo-DNA-Methylierung abzuwehren, indem sie DNMT3-Proteine an der Bindung an Chromatin hindert. Interessanterweise entdeckten wir, dass DNMT3C entscheidend für die Entfernung dieser antagonistischen Markierung von seinen Zielen ist, was darauf hindeutet, dass die Aktivität des vorgelagerten nuklearen piRNA-Wegs nicht ausreicht, um H3K4me3 von TE-Promotoren zu entfernen. Die Lsd-Demethylasen LSD1 und LSD2 waren in den Interaktomdaten angereichert. Wir validierten die Interaktion von DNMT3C mit LSD1. Keimbahnbedingtes katalytisches Knock-in von Lsd1 zeigte, dass DNMT3C DMRs normal methyliert sind, wie bei Dnmt3cWT/WT beobachtet. Sie sind jedoch auch durch H3K4me3 markiert, wie dies bei Dnmt3cKO/KO beobachtet wurde. Dies deutet darauf hin, dass DNMT3C über einen nicht-kanonischen Mechanismus der DNA-Methylierung verfügen könnte, bei dem es durch H3K4me3 markierte DNA methyliert. Wir schlagen ein Modell vor, bei dem DNMT3C stromabwärts von MIWI2 und SPOCD1 im nuklearen piRNA-Weg wirkt. LSD1 entfernt durch seine Interaktion mit DNMT3C und SPOCD1 und in Verbindung mit JARID-Proteinen das H3K4me an den piRNA-Zielen. In Abwesenheit von DNMT3C werden die aktiven Transposon-Promotoren nicht in das konstitutive Heterochromatin umgewandelt und sind durch H3K4me3 markiert, was zu einer meiotischen Katastrophe führt. Unsere Arbeit bietet mechanistische Einblicke in die DNMT3C-vermittelte TE-Inaktivierung und die Organisation des piRNA-Signalwegs im Nukleus.