Posttranslational modification of the spliceosome paralogue SNRPN links metabolic signaling to splicing regulation

Abstract

Gene duplication events give rise to paralogues that can evolve specialized functions over time. SNRPB and SNRPN are two such splicing paralogues, sharing over 90% sequence identity yet exhibiting distinct expression patterns, regulatory features, and disease associations. While SNRPB is ubiquitously expressed and essential in most tissues, SNRPN is expressed primarily in the brain and heart and is subject to genomic imprinting. The aim of this work was to investigate how these paralogues differ at the protein level, particularly focusing on their unstructured regions and their responses to cellular context. To dissect intrinsic differences between the two proteins, we used an inducible expression system in HEK cells to express 2xHA-mNEON-tagged SNRPB and SNRPN individually in the absence of endogenous SNRPB. Transcriptomic analysis revealed that SNRPN and SNRPB stabilize largely non-overlapping sets of transcripts. SNRPN preferentially stabilized genes that are involved in metabolic pathways and mitochondrial function, and SNRPN-expressing cells exhibited higher proliferation rates. In contrast, SNRPB regulated transcripts involved in cell signaling and adhesion. Despite their roles in the spliceosome, these paralogues did not significantly affect alternative splicing; instead, they appeared to modulate global splicing efficiency, particularly of long and complex transcripts. A striking difference emerged in the posttranslational regulation of SNRPN. Upon translation inhibition with cycloheximide (CHX), SNRPN – but not SNRPB – underwent a loss of detection by the SmB/B’/N (12F5) antibody, a change that correlated with decreased Arginine methylation in its proline-rich C-terminal region. Mass spectrometry revealed several SNRPN-specific methylated Arginine residues, and mutational analysis showed that replacing key Arginine residues with Lysine residues abolished this CHX-sensitive phenotype. Notably, Arginine 228 (R228) was consistently present in all mutation combinations that disrupted the phenotype but was never observed as methylated, suggesting it may instead be citrullinated. Together, these findings uncover a previously unrecognized regulatory axis in which SNRPN integrates translational and metabolic cues to modulate its posttranslational state and stabilize complex transcripts. This translationally sensitive regulation may explain why SNRPN is enriched in energy-demanding tissues such as the brain. This work establishes a framework for understanding how paralogues with nearly identical sequences can diverge through subtle, context-dependent posttranslational modifications to acquire distinct cellular roles.

Durch Genduplikationen entstehen paraloge Proteine, die im Laufe der Zeit spezialisierte Funktionen entwickeln können. SNRPB und SNRPN sind zwei solcher Spleiß-Paraloge, die zwar eine Sequenzidentität von über 90 % teilen, jedoch unterschiedliche Expressionsmuster, regulatorische Merkmale und Krankheitsassoziationen aufweisen. Während SNRPB ubiquitär exprimiert wird und in den meisten Geweben essenziell ist, wird SNRPN überwiegend im Gehirn und im Herzen exprimiert und unterliegt der genomischen Prägung. Ziel dieser Arbeit war es, Unterschiede der Paraloge auf Proteinebene zu untersuchen, insbesondere in Bezug auf ihre unstrukturierten Regionen und ihren Reaktionen auf den zellulären Kontext. Um die intrinsischen Unterschiede zwischen den beiden Proteinen zu entschlüsseln, haben wir ein induzierbares Expressionssystem in HEK-Zellen verwendet, um 2xHA-mNEON-markiertes SNRPB und SNRPN einzeln in Abwesenheit von endogenem SNRPB zu exprimieren. Transkriptom-Analysen zeigten, dass SNRPN und SNRPB überwiegend nicht-überschneidende Transkriptgruppen stabilisieren. SNRPN stabilisierte bevorzugt Gene, die an Stoffwechselwegen und mitochondrialen Funktionen beteiligt sind, und SNRPN-exprimierende Zellen wiesen höhere Proliferationsraten auf. SNRPB hingegen regulierte Transkripte, die an der Zellsignalisierung und Adhäsion beteiligt sind. Trotz ihrer Rolle im Spleißosom beeinflussten die Paraloge das alternative Spleißen nicht signifikant; stattdessen schienen sie die globale Spleiß-Effizienz zu modulieren, insbesondere bei langen und komplexen Transkripten. Ein auffälliger Unterschied zeigte sich in der posttranslationalen Regulierung von SNRPN. Nach Translationshemmung mit Cycloheximid (CHX) wurde SNRPN - nicht jedoch SNRPB - durch den SmB/B'/N (12F5)-Antikörper nicht mehr detektiert. Diese Veränderung korrelierte mit verminderter Arginin-Methylierung in der prolinreichen C-terminalen Region von SNRPN. Massenspektrometrie zeigte mehrere SNRPN-spezifische methylierte Argininreste auf, und eine Mutationsanalyse ergab, dass der Austausch von wichtigen Argininresten durch Lysinreste diesen CHX-empfindlichen Phänotyp aufhob. Arginine 228 (R228) war in allen Mutationskombinationen vorhanden, die den Phänotyp veränderten, wurde jedoch nie als methyliert detektiert, was auf eine mögliche Citrullinierung hinweisen könnte. Gemeinsam decken diese Ergebnisse eine bisher unerkannte regulatorische Achse auf, in welcher SNRPN translatorische und metabolische Hinweise integriert, um seinen posttranslationalen Zustand zu modulieren und komplexe Transkripte zu stabilisieren. Diese translationssensitive Regulierung könnte erklären, warum SNRPN besonders in Geweben mit hohem Energieverbrauch, wie dem Gehirn, angereichert ist. Diese Arbeit bietet einen Rahmen, um zu verstehen, wie Paraloge mit nahezu identischer Sequenz durch subtile, kontextabhängige posttranslationale Modifikationen divergieren können, um unterschiedliche zelluläre Rollen übernehmen.