Modulation der mikrovaskulären Biomaterialintegration in vivo mittels Polyphosphat-modifizierten Polycaprolacton-Gerüsten

Abstract

Die angiogene Modifikation des Biomaterials Polycaprolacton kann genutzt werden, um die vaskuläre Integration des Materials und somit das Einheilen nach Implantation zu verbessern. Ein vielversprechender Faktor zur Förderung der Angiogenese und Geweberegeneration nach Implantation ist anorganisches Polyphosphat (PolyP), welches natürlicherweise in Thrombozyten vorkommt und aus den elektronendichten Granula freigesetzt wird. In der Literatur konnte gezeigt werden, dass insbesondere anorganisches PolyP eine entscheidende Rolle sowohl bei der Knochenmineralisation/-regeneration als auch für den gesamten Metabolismus und die Angiogenese eine entscheidende Rolle spielt. Im Kontext der knöchernen Einheilung von Biomaterialien sind in besonderem Maße die Knochenregeneration und Angiogenese vielversprechende Ansatzpunkte. Deshalb war das Ziel der Arbeit, das angiogene Potenzial von PolyP-modifizierten Polycaprolacton-Gerüsten im Zusammenhang der vaskulären Integration in vivo mittels CAM-Assay zu analysieren. Die Herstellung der PCL-Gerüste erfolgte mittels 3D-Druck unter Verwendung eines 3D Bioplotters. Für die Modifizierung der Gerüste wurde ein Gemisch aus Calcium-PolyP Mikropartikeln und PCL Partikeln im Verhältnis 1:2 [w/v] hergestellt, welches direkt für die Herstellung der Gerüste verwendet wurde. Für die Analyse der mikrovaskulären Integration wurden die modifizierten PCL-Gerüste über einen Zeitraum von einer Woche im CAM-Assay inkubiert und anschließend qualitativ und quantitativ analysiert. Die qualitative Analyse erfolgte zunächst Lichtmikroskopisch anhand der Gefäßvernetzung, Gefäßarchitektur und Morphologie. Zudem wurden immunhistologische Untersuchungen durchgeführt, um anhand von gefäßspezifischen Färbungen (CD31, vWF, alpha-SMA) den Einfluss von PolyP auf die Verteilung der Gefäße innerhalb der CAM beurteilen zu können. Die quantitativen Analysen der angiogenen Parameter erfolge intravitalmikroskopisch unter Verwendung einer FITC-Dextran Lösung, welche direkt in das Gefäßsystem der CAM injiziert wurde. Dabei wurden die angiogenen Parameter wie Anzahl der Verzweigungspunkte, prozentuale Gefäßdichte, mittlere Gefäßdurchmesser und mittlere Gefäßlängen mittels Software „ImageJ“ analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass innerhalb der ersten 3 Tage nach Inkubation der Gerüste kein deutlicher Effekt auf die Angiogenese durch die PolyP-Modifikation im Vergleich zu den unmodifizierten Proben erreicht wird. Im Gegensatz hierzu kann nach 7 Tagen eine geringere Anzahl an Gefäßen nach Inkubation mit den PolyP-modifizierten Gerüsten im Vergleich zu den Kontrollproben beobachtet werden. Im Gegensatz hierzu zeigt sich in den immunhistologischen Analysen nach 7 Tagen in beiden untersuchten Proben eine gleichmäßige Verteilung der Gefäße in der CAM, mittig unterhalb der PCL-Gerüste, ohne erkennbare Unterschiede zwischen Kontrolle und PolyP-modifizierten Proben. Dies wird auf eine durch alpha-SMA bedingte Färbung der ausschließlich reifen Gefäße zurückgeführt, wodurch es zu einer verzerrten Darstellung der tatsächlichen Gefäßsituation innerhalb der CAM gekommen ist. Die intravitalmikroskopischen Analysen bestätigen die Beobachtungen einer reduzierten Gefäßdichte in der Lichtmikroskopie mit einer Anzahl von Verzweigungspunkten von 280/mm2 in der Kontrolle im Vergleich zu den PolyP-modifizierten Proben mit 120/mm2. Mittlere Gefäßdurchmesser und mittlere Gefäßlängen zeigten keine Unterschiede im Vergleich der PolyP-modifizierten Proben zu den Kontrollen. Möglicherweise könnte die Reduktion der Gefäßanzahl mit einer Gefäßreorganisation im Sinne einer „Gefäßnormalisierung“ und der Bildung funktioneller Gefäße zusammenhängen. Eine weitere mögliche Erklärung könnte auch ein anti-angiogener Effekt von PolyP sein, welcher allerdings im Gegensatz zur bisher ausschließlich in vitro gewonnen Datenlage in der Literatur stünde. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass durch die in dieser Arbeit durchgeführte Modifikation von PCL-Gerüsten mittels PolyP ein primär anti-angiogener Effekt in ovo beschrieben werden konnte. Es wird in zukünftigen Arbeiten notwendig sein, die sich widersprechenden Ergebnisse der in vitro und in vivo Ergebnisse weiter zu untersuchen und die zugrundeliegenden Mechanismen aufzuklären.