Development of a real-time PCR assay for the direct quantification of circulating cell-free mitochondrial DNA in human blood plasma: preanalytical considerations, challenges, and clinical implications

Abstract

Mitochondria are multifunctional organelles increasingly recognized as key players in stress research due to their ability to sense and respond to external and internal stressors. As such, they are central to our understanding of cellular resilience and signaling pathways in response to acute or chronic stress. One consequence of prolonged mitochondrial stress and subsequent dysfunction is the release of mitochondrial components, such as mitochondrial DNA (mtDNA) into the circulation. In this context, circulating cell free nucleic acids (cf-DNA) have emerged as biomarker in both pathological and physiological conditions. To date the relevance of cf-DNA, particularly in liquid biopsy, is well established and widely applied in clinical routine and medical practice. Quantifying circulating cell free mtDNA (ccf-mtDNA) therefore offers a valuable tool for gaining insights into mitochondrial responses and the broader cellular mechanisms activated under stressful conditions. However, quantifying ccf-mtDNA remains challenging due to several technical and pre-analytical considerations. A method for measuring and quantifying ccf-mtDNA in human blood plasma samples using direct quantitative polymerase chain reaction (qPCR) without the need for prior isolation is presented in this thesis. This approach shows significant advantages compared to traditional methods including reduced sample processing time, lower risk of sample loss, cost efficiency and improved overall assay performance. The establishment of the qPCR-assay implemented serval recommendation guidelines to ensure accuracy and reproducibility. To evaluate the applicability of the newly developed assay in clinical samples, ccf-mtDNA concentrations were measured in healthy individuals in respect to their chronic stress load. The results revealed a negative correlation between ccf-mtDNA and the perceived chronic stress in healthy individuals, whereas no such correlation was observed for cf-nDNA. To further investigate this stress-associated relationship, ccf-mtDNA kinetics was assessed after acute stress induction using the Trier Social Stress Test (TSST), a well-established and controlled procedure for eliciting physiological stress response in both healthy individuals and panic disorder (PD) patients. The findings of the present thesis demonstrated that while ccf-mtDNA concentrations remained unchanged in the healthy control group, they showed a significant decrease 10- minutes after acute stress induction in the PD patients. Taken together the results provide a solid foundation for the direct quantification of ccf-mtDNA concentrations in clinical samples and open new opportunities to further investigate its role in stress- research and a wide range of conditions such as inflammatory diseases, cancer, neurodegenerative disorders, and more.

Mitochondrien sind multifunktionale Organellen, die aufgrund ihrer Fähigkeit, externe und interne Stressoren zu erkennen und darauf zu reagieren, zunehmend in den Fokus in der Stressforschung rücken. Als solche sind sie von zentraler Bedeutung für unser Verständnis der zellulären Resilienz und der Signalwege, die als Reaktion auf akuten oder chronischen Stress aktiviert werden. Eine Folge von anhaltendem mitochondrialem Stress und daraus resultierender Dysfunktion ist die Freisetzung mitochondrialer Komponenten, wie z. B. mitochondrialer DNA (mtDNA), in den Blutkreislauf. In diesem Zusammenhang haben sich zirkulierende, zellfreie Nukleinsäuren (cf-DNA) sowohl unter pathologischen als auch bei physiologischen Bedingungen als informative Biomarker erwiesen. Bis heute ist die Bedeutung der cf-DNA, insbesondere bei der Flüssigbiopsie, gut etabliert und wird in der klinischen Routine und in der medizinischen Praxis weitgehend angewendet. Die Quantifizierung von zirkulierend zellfreier mtDNA (ccf-mtDNA) bietet daher ein wertvolles Instrument, um Einblicke in die mitochondriale Funktionalität und die breiteren zellulären Mechanismen zu gewinnen, die unter Stressbedingungen aktiviert werden. Die Quantifizierung von ccf-mtDNA stellt jedoch aufgrund verschiedener technischer und präanalytischer Faktoren eine Herausforderung dar. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Messung und Quantifizierung von ccf-mtDNA in menschlichen Blutplasmaproben mittels direkter quantitativer Polymerasekettenreaktion (qPCR) vorgestellt, ohne dass eine vorherige Isolierung erforderlich ist. Dieser Ansatz weist im Vergleich zu herkömmlichen Methoden erhebliche Vorteile auf, darunter eine kürzere Probenverarbeitungszeit, ein geringeres Risiko von Probenverlusten, Kosteneffizienz und eine verbesserte Gesamtleistung des Assays. Bei der Etablierung des qPCR-Assays wurden mehrere Empfehlungsrichtlinien umgesetzt, um Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Um die Anwendbarkeit des neu entwickelten Assays in klinischen Proben zu bewerten, wurden die ccf-mtDNA-Konzentrationen bei gesunden Personen in Abhängigkeit von ihrer chronischen Stressbelastung gemessen. Die Ergebnisse zeigten eine negative Korrelation zwischen ccf-mtDNA und der wahrgenommenen chronischen Stressbelastung bei gesunden Personen, während für cf-nDNA keine derartige Korrelation festgestellt wurde. Um diese stressassoziierte Beziehung weiter zu untersuchen, wurde die Kinetik der ccf-mtDNA nach einer akuten Stressinduktion mit dem Trier Social Stress Test (TSST) untersucht, einem etablierten und kontrollierten Verfahren zur Auslösung einer physiologischen Stressreaktion sowohl bei gesunden Personen als auch bei Patienten mit Panikstörung (PD). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die ccf-mtDNA-Konzentrationen in der gesunden Kontrollgruppe unverändert blieben, während sie bei den PD-Patienten 10 Minuten nach der akuten Stressinduktion signifikant abnehmen. Insgesamt bilden die Ergebnisse eine solide Grundlage für die direkte Quantifizierung von ccf-mtDNA-Konzentrationen in klinischen Proben und Eröffnen neue Möglichkeiten zur Untersuchung ihrer Rolle im Bereich der Stressforschung bei einer Vielzahl von Erkrankungen wie Entzündungskrankheiten, Krebs, neurodegenerativen Störungen und anderen.