Investigations of genome instability utilizing quantitative proteomics

Abstract

The field of mass spectrometry-based proteomics has had a profound impact on discoveries in almost every field of science. Specifically, bottom-up proteomics enables the exploration of scientific questions at a high-throughput and proteome-wide level. In this thesis, mass spectrometry-based proteomics was employed to understand aspects of genome instability related to: 1) telomere biology in Caenorhabditis elegans , 2) phylogenetic diversity of recognition and repair of in vitro DNA damage lesions, and 3) DNA damage kinetics in Tetrahymena thermophila. Article I (Dietz et al. 2021) describes the extensive characterization of the first novel double-stranded telomere binders in C. elegans , TEBP-1 and TEBP-2. These proteins were discovered using in vitro telomere pulldown assays coupled with label-free and dimethyl quantitative mass spectrometry. TEBP-1 and TEBP-2 bind directly and specifically to double-stranded telomeric DNA. Both proteins are critical to the negative and positive regulation of telomere homeostasis. The double knockout strain of tebp-1;tebp-2 exhibits severe germline arm atrophy and synthetic sterility, suggesting their critical role in fertility. TEBP-1 and TEBP-2dimerize and directly interact with the known single-stranded binder POT-1, thereby connecting them to the known telomere complex in C. elegans. Article II (Nischwitz and Schoonenberg et al., 2023) explores the conservation of recognition and repair of DNA damage lesions. Due to the imperative need for accurate maintenance of the genome, DNA repair has been highly conserved across all domains of life. To study both the shared and unique elements of the DNA damage response, we conducted a phylointeractomic study to identify enriched binders in 11 different species at the 8-oxoG and abasic lesions, as well as a uracil base incorporated into DNA. While numerous binders were canonical DNA damage factors, we also observed enrichment of proteins not previously associated with DNA repair. Through orthology, network, and domain analysis, we linked 44 proteins that were previously unassociated to DNA repair. Article III (unpublished, Nischwitz and Schoonenberg et al., xxxx) delves into the kinetics of the DNA damage response (DDR) in the ciliate Tetrahymena thermophila (Tetrahymena) . To date, there have been limited studies that combine the power of proteomics and transcriptomics to investigate DNA damage kinetics across various treatments. Our screen monitored the dynamic DNA damage response over eight hours after exposure to six different mutagens. We observed upregulation of previously associated DNA damage repair pathways, as well as unexpected DDR crosstalk. All treatments elicited a dynamic response at both the transcript and protein level. Through unsupervised machine learning clustering, we examined expression profile trends to gain a more comprehensive understanding of the DDR, as many of these proteins exhibited damage-specific responses. Currently, we are employing a knockdown system to target a subset of these PARP-related proteins to further characterize their specific roles in Tetrahymena.

Artikel I (Dietz et al. 2021) beschreibt die umfassende Charakterisierung der ersten bekannten doppelsträngigen Telomerbinder in C. elegans, TEBP-1 und TEBP-2. Diese Proteine wurden mit Hilfe von in vitro Telomer-Pulldown-Assays in Verbindung mit markierungsfreier und quantitativer Dimethyl-Massenspektrometrie entdeckt. TEBP-1 und TEBP-2 binden direkt und spezifisch an doppelsträngige telomere DNA. Beide Proteine sind entscheidend für die negative und positive Regulierung der Telomer-Homöostase. Der Doppel-Knockout-Stamm vontebp-1;tebp-2 weist eine schwere Keimbahnarmatrophie und synthetische Sterilität auf, was darauf hindeutet, dass beide Proteine eine entscheidende Rolle für die Fruchtbarkeit spielen.TEBP-1 und TEBP-2 dimerisieren und interagieren direkt mit dem bekannten EinzelstrangbinderPOT-1, wodurch sie mit dem bekannten Telomerkomplex in C. elegans verbunden sind. Artikel II (Nischwitz und Schoonenberg et al., 2023) befasst sich mit der Erhaltung der Erkennung und Reparatur von DNA-Schäden. Aufgrund der zwingenden Notwendigkeit, das Genom akkurat zu erhalten, ist die DNA-Reparatur in allen Bereichen des Lebens in hohem Maße konserviert. Um sowohl die gemeinsamen als auch die einzigartigen Elemente derDNA-Schadensreaktion zu untersuchen, haben wir eine phylointeraktomische Studie durchgeführt, um in 11 verschiedenen Arten angereicherte Proteine, die an den 8-oxoG- und abasischen Läsionen sowie an einer in die DNA eingebauten Uracilbase binden, zu identifizieren. Bei zahlreichen Bindungsstellen handelte es sich um kanonische DNA-Schadensfaktoren, aber wir beobachteten auch eine Anreicherung von Proteinen, die bisher nicht mit der DNA-Reparatur in Verbindung gebracht wurden. Durch Orthologie-, Netzwerk und Domänenanalysen konnten wir 44 Proteine identifizieren, die zuvor nicht mit der DNA-Reparatur assoziiert wurden. Artikel III (unveröffentlicht, Nischwitz und Schoonenberg et al., xxxx) befasst sich mit der Kinetik der DNA-Schadensreaktion (DDR) in dem Ciliaten Tetrahymena thermophila( Tetrahymena ). Bislang gibt es nur wenige Studien, die die Leistungsfähigkeit von Proteomik und Transkriptomik kombinieren, um die Kinetik von DNA-Schäden bei verschiedenen Behandlungen zu untersuchen. In unserem Screening wurde die dynamische DNA-Schadensreaktion über acht Stunden nach der Exposition gegenüber sechs verschiedenen Mutagenen überwacht. Wir beobachteten die Hochregulierung von zuvor assoziierten DNA-Schadensreparaturwegen sowie unerwartete DDR-Crosstalk. Alle Behandlungen lösten eine dynamische Reaktion sowohl auf der Transkriptions- als auch auf der Proteinebene aus. Mit Hilfe von unüberwachten maschinellen Lernens untersuchten wir die Trends der Expressionsprofile, um ein umfassenderes Verständnis der DDR zu gewinnen, da viele dieser Proteine schadensspezifische Reaktionen zeigten. Gegenwärtig setzen wir ein Knockdown-System ein, um eine Untergruppe dieser PARP-verwandten Proteine anzugreifen und ihre spezifische Rolle in Tetrahymena weiter zu charakterisieren.