Analysis of senescence in glioblastoma cells exposed to temozolomide - a study for the identification of senescence maintaining pathways and novel senolytic agents

Abstract

The alkylating drug Temozolomide (TMZ) in combination with ionising radiation (IR) represents the first-line treatment in glioblastoma (GBM) therapy. While cancer treatment aims for triggering cell death to eliminate the tumour, cancer cells developed strategies to escape cell death: they activate cell survival pathways, including cellular senescence (CSEN) upon chemotherapeutic treatment. Over the past years in vitro and in vivo studies demonstrated that senescent cells could escape their senescent state and re-start proliferation, which may result in delayed tumour progression. Additionally, CSEN is accompanied by the senescence associated secretory phenotype (SASP), which includes pro-inflammatory cytokines, and drives senescence and tumorigenesis, rendering CSEN an unfavourable outcome of chemotherapy. A better understanding of the cellular responses to chemotherapy as well as strategies to eliminate senescent cells are therefore desirable. Here, we focused on the effect of TMZ treatment regarding CSEN of the malignant brain tumour GBM. The following main questions were addressed: 1) What are the kinetics of TMZ-induced genotoxic, cytotoxic, and cytostatic effects and how are senescent cells characterised? 2) Which pathways are responsible for the maintenance of GBM cells in the TMZ-induced senescent state? 3) Which treatment options, including natural and synthetic compounds, can be used to reduce the load of TMZ-induced senescent cells in GBM? To gain insight into the cellular processes following TMZ treatment, we analysed the formation of DSBs over time, and the induction of early and late apoptosis/necrosis (cell death) and CSEN. We found a significant level of DNA double-strand breaks (DSBs) 3 d after treatment which persisted up to 10 d following the onset of TMZ exposure. In line with the increase in DSBs, cell death and predominantly CSEN were provoked 3 d following TMZ treatment and increased up to day 5 and 8, respectively. We then analysed TMZ-induced senescent cells and identified pathways essentially involved in maintaining the senescent state. The DNA damage response (DDR) factors ATM, ATR, CHK1, CHK2, p53 and p21 were found to be active in TMZ-induced senescent cells. For senescence maintenance, the ATM/ATR-CHK1-p53-p21 axis as well was a pathway involving NF-kB were involved, as revealed from inhibitor experiments. Since the autophagy inhibitor chloroquine was senolytic, we conclude that activation of autophagy is required for keeping cells in the senescent state. To increase cell death levels following TMZ treatment, we co-treated LN229 and A172 cells with IR, N-(2-chloroethyl)-N'-cyclohexyl-N-nitrosourea (CCNU, lomustine) or methadone (MTD) and screened for natural compounds that specifically drive senescent cells into cell death, while proliferating cells are unharmed. No increase in cell death levels in the senescent cell population was observed upon co-treatment of GBM cells with TMZ and CCNU or MTD. An additive effect on cell death was observed when GBM cells were first treated with TMZ and irradiated 3 h later, or first irradiated and treated with TMZ 6 h later. Screening of natural compounds for their senolytic activity identified artesunate and fisetin, but not curcumin, as novel senolytic agents in GBM cells in vitro under the treatment conditions used. In a last step we identified senescent cells in patient derived tumour samples from matched primary and recurrent GBM via histochemistry staining. Increased DSBs combined with increased levels of trimethylated lysin on histone 3 (H3K27me3) served as senescence marker. Comparison of primary and recurrent tumour samples showed significantly higher DSBs and H3K27me3 but significantly lower cell death levels in the recurrent tumour samples. These results indicate that not only in vitro but also in vivo senescent cells accumulate following TMZ treatment of GBM. Overall, the data presented in this study demonstrate that TMZ-induced CSEN is the main trait in GBM cells in vitro and very likely also in vivo. The identification of proteins involved in the TMZ-induced CSEN maintaining pathways in GBM cells might provide a reasonable support in the treatment of cancer. Also, the identification of novel senolytic agents and timing of the combination treatment with TMZ and IR in GBM cells in vitro can help to develop optimized treatment regiments for GBM.

Das DNA-methylierende Zytostatikum Temozolomid (TMZ) in Kombination mit ionisierender Strahlung (IR) ist die erste Wahl bei der Behandlung des bösartigen Hirntumors Glioblastom (GBM). Während die Krebsbehandlung darauf abzielt, den Zelltod spezifisch in Tumorzellen auszulösen, um den Tumor zu beseitigen, haben die Krebszellen Strategien entwickelt, um dem Zelltod zu entgehen: Sie aktivieren Zellüberlebenswege, einschließlich die zelluläre Seneszenz (engl. cellular senescence, (CSEN)) bei chemotherapeutischer Behandlung. In den letzten Jahren haben In-vitro- und In-vivo-Studien gezeigt, dass seneszente Zellen ihrem seneszenten Zustand entkommen und sich wieder vermehren können, was zu einer verzögerten Tumorprogression führen kann. Darüber hinaus wird die CSEN von einem Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP) begleitet, welches die Sekretion entzündungsfördernder Zytokine beinhaltet und die Seneszenz und Tumorigenese fördert, was CSEN zu einem ungünstigen Ergebnis der Chemotherapie macht. Ein besseres Verständnis der zellulären Reaktionen auf die Chemotherapie sowie Strategien zur Beseitigung seneszenter Zellen sind daher wünschenswert. Hier haben wir uns auf die Auswirkungen der TMZ-Behandlung auf die CSEN des malignen Hirntumors GBM konzentriert. Die folgenden Hauptfragen wurden untersucht: 1) Wie ist die Kinetik der TMZ-induzierten genotoxischen, zytotoxischen und zytostatischen Effekte und wie werden seneszente Zellen charakterisiert? 2) Welche Signalwege sind für die Aufrechterhaltung des TMZ induzierten seneszenten Zustands von GBM-Zellen verantwortlich? 3) Welche Behandlungsmöglichkeiten, einschließlich natürlicher und synthetischer Substanzen, können eingesetzt werden, um die Belastung durch TMZ-induzierte seneszente Zellen im GBM zu verringern? Um einen Einblick in die zellulären Prozesse nach einer TMZ-Behandlung zu erhalten, analysierten wir die Bildung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) im Zeitverlauf sowie die Induktion von früher und später Apoptose/Nekrose (Zelltod) und CSEN. Drei Tage nach der Behandlung mit TMZ fanden wir ein signifikantes Niveau von DSBs, welches bis zu 10 Tage nach Beginn der TMZ-Exposition anhielt. Im Einklang mit dem Anstieg der DSBs wurden 3 Tage nach der TMZ-Behandlung Zelltod und vor allem CSEN ausgelöst, die bis zum 5. bzw. 8. Tag nach Beginn der Behandlung zunahmen. Anschließend analysierten wir TMZ-induzierte seneszente Zellen und identifizierten Signalwege, die wesentlich an der Aufrechterhaltung des seneszenten Zustands beteiligt sind. Es wurde festgestellt, dass die DNA-Schadensreaktionsfaktoren ATM, ATR, CHK1, CHK2, p53 und p21 in TMZ-induzierten seneszenten Zellen aktiv sind. Durch Inhibitor-Experimenten wurde gezeigt, dass für die Aufrechterhaltung der Seneszenz die ATM/ATR-CHK1-p53-p21-Achse sowie ein NF-kB-Signalweg involviert sind. Da der Autophagie-Hemmer Chloroquin senolytisch wirkte, schlussfolgern wir, dass die Aktivierung der Autophagie wesentlich für die Aufrechterhaltung des seneszenten Zustands der Zellen ist. Um den Zelltod nach einer TMZ-Behandlung zu erhöhen, behandelten wir LN229- und A172-Zellen gleichzeitig mit IR, N-(2-Chlorethyl)-N'-cyclohexyl-N-nitrosoharnstoff (CCNU, Lomustin) oder Methadon (MTD) und suchten nach natürlichen Verbindungen, die seneszente Zellen spezifisch in den Zelltod treiben, während proliferierende Zellen unversehrt bleiben. Bei der gleichzeitigen Behandlung von GBM-Zellen mit TMZ und CCNU oder MTD wurde kein Anstieg des Zelltods in der seneszenten Zellpopulation beobachtet. Ein additiver Effekt auf den Zelltod wurde beobachtet, als die GBM-Zellen erst mit TMZ behandelt und 3 Stunden später bestrahlt wurden, oder erst bestrahlt und 6 h später mit TMZ behandelt wurden. Beim Screening von Naturstoffen auf ihre senolytische Aktivität unter den verwendeten Versuchsbedingungen wurden Artesunat und Fisetin, jedoch nicht Curcumin, als neuartige senolytische Wirkstoffe in GBM-Zellen in vitro identifiziert. In einem letzten Schritt identifizierten wir mittels histochemischer Färbung seneszente Zellen in von Patienten entnommenen Tumorproben von gematchten primären und rezidivierenden GBM. Erhöhte DSBs in Kombination mit erhöhten Werten von trimethyliertem Lysin auf Histon 3 (H3K27me3) dienten als Seneszenzmarker. Der Vergleich von primären und rezidivierenden GBM-Tumorproben ergab signifikant höhere DSBs und H3K27me3, aber signifikant niedrigere Zelltodwerte im Rezidiv. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich nach einer TMZ-Behandlung von GBM nicht nur in vitro, sondern auch in vivo seneszente Zellen ansammeln. Insgesamt zeigen die in dieser Studie präsentierten Daten, dass TMZ-induziertes CSEN das Hauptmerkmal in GBM-Zellen in vitro und sehr wahrscheinlich auch in vivo ist. Die Identifizierung von Proteinen, die an den TMZ-induzierten CSEN-Erhaltungswegen in GBM-Zellen beteiligt sind, könnte eine sinnvolle Unterstützung bei der Behandlung von Krebs sein. Auch die Identifizierung neuartiger senolytischer Wirkstoffe und die Untersuchung der zeitlichen Abfolge der Kombinationsbehandlung mit TMZ, IR und Senolytika an GBM-Zellen könnte dazu beitragen, optimierte Behandlungsschemata für die Therapie des GBM zu entwickeln.